空間學習記憶訓練對大鼠海馬Caveolin-1蛋白表達的影響

嵇志紅，鄒 偉

（1.大連大學 醫學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧師范大學 生命科學院，遼寧 大連 116029）

空間學習記憶訓練對大鼠海馬Caveolin-1蛋白表達的影響

嵇志紅1，鄒 偉2

（1.大連大學 醫學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧師范大學 生命科學院，遼寧 大連 116029）

探討空間學習記憶訓練后大鼠海馬Caveolin-1（Cav-1）蛋白表達的變化。采用Morris水迷宮實驗檢測大鼠的空間學習記憶能力，Western Blot方法檢測大鼠海馬Cav-1蛋白表達的變化。結果顯示：水迷宮實驗中，與青年訓練組比，老年訓練組大鼠的逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05，P＜0.01），穿臺次數明顯減少(P＜0.05)，在原平臺象限的停留時間明顯縮短(P＜0.05)。Western Blot檢測表明，與青年和老年對照組比，青年和老年水迷宮訓練組大鼠海馬Cav-1蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與青年對照組比，老年對照組大鼠海馬Cav-1蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與青年訓練組比，老年訓練組大鼠海馬Cav-1蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。結果提示Cav-1蛋白可能參與了空間學習記憶過程。

空間學習記憶；Caveolin-1蛋白；海馬

Caveolae是細胞質膜上特殊的凹陷結構（胞膜窖），含有豐富的膽固醇和鞘磷脂。Caveolin-1（Cav-1）是 Caveolae的主要結構組分和標志蛋白，在膽固醇運輸、膜組裝、信號轉導和腫瘤發生等過程中發揮著重要的作用[1-2]。研究表明，在胚胎發育過程中腦內幾乎沒有Cav-1蛋白的表達，但生后Cav-1表達逐漸增加，成年后表達下調，表明Cav-1的表達與生后腦發育密切相關[3]。近年研究還發現，Cav-1與腦功能的生理和病理變化有關，它影響神經發育、突觸可塑性、神經退行性疾病的發生等過程[4-5]。有實驗表明，Y-迷宮分辨學習訓練后大鼠皮層內 Cav-1表達顯著升高，提示Cav-1可能在分辨學習記憶過程中起作用[6]。但目前為止，有關Cav-1是否參與空間學習記憶過程及其作用機制尚未見報道。本實驗采用 Morris水迷宮對青年和老年大鼠進行空間學習記憶訓練，通過Western blot檢測空間學習記憶訓練后Cav-1表達的變化，為探討Cav-1在空間學習記憶過程中的作用提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

3月齡（青年）與 18月齡（老年）健康雄性Spague-Dawley大鼠各16只，購于大連醫科大學SPF實驗動物中心。青年雄性大鼠隨機分為2組：青年對照組（YC），青年訓練組（YT）。老年大鼠也隨機分為2組：老年對照組（OC），老年訓練組（OT）。各組大鼠嚴格按飼養條件分籠飼養，標準鼠食，自由飲水，自然晝夜。

1.2 試劑與儀器

抗兔 caveolin-1（N-20）多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；HRP-抗兔IgG與抗鼠actin單克隆抗體購自武漢博士德生物公司；ECLTM試劑購于美國Amersham Biosciences公司；其它試劑為國產分析純。DMS-2型Morris水迷宮（中國醫學科學院藥物研究所）；全自動酶標儀（SUNRISE TECAN公司）；MV-Ⅱ型雙垂直板式電泳槽和PS-9型半干式轉移電泳儀（大連竟邁生物科技有限公司）；SuperT21離心機（美國索福公司）。

1.3 Morris水迷宮空間學習記憶訓練

共歷時6 d。前5 d進行定位航行試驗，隱蔽平臺置于東南象限中央水面下1 cm，每只大鼠每天訓練4次，每次120 s，兩次間隔20 min，儀器自動記錄從入水到找到隱蔽平臺并立于其上所需時間（逃避潛伏期），數據取4次均值。第6 d進行空間探索試驗，撤去平臺，然后在西北象限（原平臺對側象限）入水點將大鼠面向池壁放入水中，測定120 s內在4個象限的游泳時間，其中東南象限（原平臺象限）的時間為記憶保持時間，同時記錄大鼠2 min內穿過原平臺象限的次數。

1.4 Western blot分析

實驗結束后斷頭處死各組大鼠，冰上分離海馬，稱重后置于腦蛋白裂解液中，冰上勻漿裂解1～2 h，4℃冷凍離心機 10 000 r/min離心 15 min，取上清，Bradford法進行蛋白定量。制備 12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，取100 μg總蛋白上樣，電泳2 h；半干轉移法轉膜30 min(PVDF膜)；5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h；Cav-1抗體(1：1000) 4℃孵育過夜，PBST漂洗3次，每次10 min；加入HRP-抗兔IgG(1：6000)室溫搖床中孵育1 h，PBST洗3次，每次5～10 min；ECL顯色，x光片曝光。凝膠成像系統對膠片進行薄層密度掃描，記錄相應條帶的透射光積分光密度(IOD)值反映蛋白含量，β-actin 條帶作為內參。

1.5 數據統計分析

數據以x±s表示，應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，組間差異用t檢驗，P〈0.05表示有顯著性差異。

2 結果

2.1 青年與老年大鼠空間學習記憶能力的變化

水迷宮定位航行實驗中，隨著訓練天數增加，青年組與老年組大鼠的逃避潛伏期均呈縮短趨勢，但青年組的逃避潛伏期在第4、第5天已明顯縮短，而老年組縮短的不明顯。與青年組大鼠相比較，除第二天外，其它天數老年組大鼠的逃避潛伏期均明顯延長（P＜0.05，P＜0.01），尤以第4、第5天明顯（見表1）。空間探索試驗中，與青年組比，老年組大鼠的穿臺次數及在原平臺象限的停留時間均明顯少于青年組(P＜0.05)，而在對側平臺象限的停留時間無明顯差異。

表1 定位航行實驗中大鼠的逃避潛伏期（s）（n=8）

表2 空間探索試驗中大鼠的穿臺次數和象限停留時間（n=8）

2.2 空間學習記憶對海馬Cav-1蛋白表達的影響

為研究Cav-1蛋白在空間學習記憶中的作用，我們選擇青年大鼠（YT）和老年大鼠（OT）進行Morris水迷宮空間分辨學習訓練，以不訓練（只游泳不找平臺）的青年大鼠（YC）和老年大鼠（OC）作為對照。水迷宮訓練結束后，Western blot檢測了海馬 Cav-1蛋白的表達。結果表明，青年和老年水迷宮訓練組大鼠海馬內 Cav-1蛋白表達分別顯著高于青年和老年對照組海馬（P＜0.05），而且老年對照組大鼠海馬Cav-1蛋白表達顯著高于青年對照組（P＜0.01），老年訓練組大鼠海馬 Cav-1蛋白表達顯著高于青年訓練組（P＜0.01）。結果提示Cav-1蛋白可能參與了空間學習記憶過程（見圖1）。

圖1 空間學習記憶后海馬Caveolin-1蛋白表達

3 討論

學習和記憶是構成人腦智能的要素。中樞神經系統內突觸聯系的復雜性和可塑性是學習記憶的神經生理學基礎，但其詳細機制目前尚不清楚。隨著增齡，大腦在神經生理、生化及組織形態學等方面發生一系列退行性改變，即腦老化，臨床最突出的特征之一就是學習記憶能力減退。越來越多的證據表明腦老化與突觸可塑性的“丟失”有關[7-8]。突觸傳遞過程及突觸可塑性形成涉及許多蛋白參與。目前已知海馬內與學習記憶信號轉導相關的蛋白約有百余種，這些信號分子通過啟動細胞內不同的信號通路，影響海馬突觸可塑性，在學習記憶及腦功能的調節中發揮重要的作用。Cav-1是細胞質膜小窩的標志蛋白，近年來人們對Cav-1的研究主要集中在癌癥、心血管疾病、糖尿病、肌營養不良、炎癥反應等方面，但最近發現中樞神經系統也有 Cav-1蛋白的表達，而且腦發育不同階段Cav-1蛋白的表達水平不同。也有研究表明在海馬神經元軸突和樹突突起中有 Cav-1的表達，過量表達Cav-1的PC12細胞在損傷后伸出突起的數目增加[9]。這些研究表明，神經細胞內Cav-1的表達可能與突觸可塑性活動有關。

以往研究發現，經過 Y-迷宮學習訓練的青年大鼠海馬、前額葉皮層內Cav-l蛋白的表達與未訓練大鼠比較，均有顯著增加[10]。由于海馬與空間記憶的形成密切相關，因此本實驗選用可以反應空間學習記憶能力變化的 Morris水迷宮，作為行為訓練的實驗平臺。結果表明，與青年大鼠比，老年大鼠水迷宮實驗的逃避潛伏期明顯延長，穿臺次數明顯減少，在原平臺象限的停留時間明顯縮短，這些說明老年大鼠的空間學習記憶能力較差。進一步Western blot檢測表明，無論青年還是老年大鼠，Morris水迷宮訓練后海馬內Cav-1的表達都顯著升高，這與我們以往的實驗結果一致，說明Cav-1參與了空間學習記憶過程，它的表達升高可能通過某種機制加強了突觸可塑性。另外本實驗還發現，老年大鼠海馬內Cav-1表達要明顯高于青年大鼠，這似乎與其加強空間學習記憶能力相違背，但也可以這樣認為，由于老年大鼠的空間學習記憶能力減退，Cav-1表達增高可以作為一種代償機制。

綜上所述，Cav-1蛋白與空間學習記憶密切相關。至于 Cav-1參與空間學習記憶的機制及其信號轉導途徑，有待于后續實驗進一步研究。

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[3] Cameron PL, Ruffin JW, Bollag R, et al. Identification of caveolin and caveolin-related proteins in the brain [J]. J Neurosci, 1997, 17(24): 9520-9535.

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Effects of Spatial Learning-memory Training on Expression of Caveolin-1 in Rat Hippocampus

JI Zhi-hong1, ZOU Wei2
（1. Medical College of Dalian University, Dalian 116622, China; 2. College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China）

To investigate the effects of spatial learning-memory training on expression of Caveolin-1 in rat hippocampus. Spatial learning-memory ability was tested by Morris water maze test, and the expression of Caveolin-1 in hippocampus was examined by Western blot. Results showed that the escape latency in aged training group was significantly longer (P＜0.05, P＜0.01), The number of rats through the platform was significantly decreased (P＜0.05), and the time spent in the original quadrant that previously contained the platform was significantly shorter (P＜0.05), compared with the youth training group. Western blot showed the expression of Caveolin-1 in hippocampus of youth training and aged training group was significantly enhanced, compared with the youth and aged control group respectively (P＜0.05), and significantly enhanced in hippocampus of aged control group than youth control group (P＜0.01), and significantly enhanced in hippocampus of aged training group than youth training group (P＜0.01). The results suggest that Caveolin-1 might be involved in the process of spatial learning and memory.

spatial learning-memory; Caveolin-1 protein; hippocampus

R741

：A

：1008-2395(2013)06-0035-03

2013-10-15

國家自然科學基金資助項目(30970353)。

嵇志紅（1964-），女，副教授，研究方向：神經生物學。