經(jīng)顱和經(jīng)脊髓重復(fù)磁刺激對脊髓半橫斷大鼠運動功能的作用①

潘鈺，汪璇，劉萍，陳贊，王玉蘭

經(jīng)顱和經(jīng)脊髓重復(fù)磁刺激對脊髓半橫斷大鼠運動功能的作用①

潘鈺1，汪璇2，劉萍2，陳贊3a，王玉蘭3b

目的 觀察經(jīng)顱和經(jīng)脊髓重復(fù)磁刺激對脊髓半橫斷大鼠運動功能的影響。方法建立T10大鼠脊髓半橫斷模型，脊髓半橫斷大鼠于術(shù)后4 d分別給予經(jīng)顱和經(jīng)脊髓重復(fù)磁刺激治療，刺激強度為最大輸出強度的35%，刺激頻率5 Hz，每序列5 s，間歇2 min，連續(xù)10個序列，每天1次，每周5 d，連續(xù)2周。各組大鼠治療前和治療后進行BBB評分和水平梯子實驗評價運動功能；術(shù)后38 d取患側(cè)下肢脛前肌行降鈣素基因相關(guān)肽免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果經(jīng)顱磁刺激組大鼠手術(shù)17 d后各時間點BBB評分和水平梯子實驗步態(tài)正確率高于術(shù)后3 d和脊髓損傷組(P＜0.05)；經(jīng)脊髓磁刺激組大鼠手術(shù)10 d后各時間點BBB評分和步態(tài)正確率高于術(shù)后3 d和脊髓損傷組(P＜0.05)，術(shù)后10 d步態(tài)正確率高于經(jīng)顱磁刺激組(P＜0.05)。經(jīng)顱和經(jīng)脊髓磁刺激組大鼠脛前肌運動終板降鈣素基因相關(guān)肽表達顯著高于脊髓損傷組(P＜0.001)。結(jié)論早期經(jīng)顱和經(jīng)脊髓磁刺激可促進脊髓半橫斷大鼠運動功能改善，并改變遠端肌肉的可塑性，經(jīng)脊髓磁刺激可加速脊髓半橫斷大鼠運動功能恢復(fù)。

經(jīng)顱磁刺激；經(jīng)脊髓磁刺激；脊髓半橫斷；運動功能；恢復(fù)；大鼠

[本文著錄格式]潘鈺，汪璇，劉萍，等.經(jīng)顱和經(jīng)脊髓重復(fù)磁刺激對脊髓半橫斷大鼠運動功能的作用[J].中國康復(fù)理論與實踐,2013,19(4):324-328.

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉的可塑性變化，是運動功能恢復(fù)的重要機制[1-3]。脊髓損傷后的可塑性可發(fā)生于皮層、皮層下、脊髓和肌肉等部位，調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性變化是脊髓損傷后康復(fù)治療的重要手段[4-5]。磁刺激治療通過利用時變電流流入線圈，產(chǎn)生時變磁場，從而在組織內(nèi)感應(yīng)出電流。臨床和動物研究證實，磁刺激可調(diào)節(jié)正常個體和神經(jīng)損傷后的興奮性[4,6]，進而逐漸被臨床認(rèn)識，并應(yīng)用到各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病后神經(jīng)功能調(diào)節(jié)治療中[7-8]。磁刺激治療脊髓損傷的研究起步較晚，不同刺激部位、刺激療程和刺激劑量可帶來不同的治療效果。本研究擬通過給予脊髓半橫斷大鼠經(jīng)顱和脊髓重復(fù)磁刺激，分析磁刺激治療的有效治療部位，為磁刺激治療的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康雄性清潔級SD大鼠42只，由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院動物實驗室提供，體重250～300 g。分為5組：①正常對照組(n=6)；②假手術(shù)組(n=6)；③脊髓損傷組(SCI組，n=10)；④經(jīng)顱磁刺激組(rTMS組，n=10)；⑤經(jīng)脊髓磁刺激組(SC-MS組，n=10)。

1.2 脊髓半橫斷模型

實驗動物術(shù)前8 h禁食，4 h禁水。10%水合氯醛3.5 ml/100 g腹腔麻醉，T10處椎板切開后，在T10-11間用虹膜刀片橫斷右半側(cè)脊髓。同側(cè)后肢呈現(xiàn)軟癱，刺激無反應(yīng)，關(guān)閉切口。假手術(shù)組僅椎板切開，不橫斷脊髓。

1.3 磁刺激

rTMS組大鼠和SC-MS組大鼠于造模后第4天開始磁刺激治療。采用Magstim rapid2磁刺激儀(英國Magstim公司，最大輸出強度2.2 T)和蝶形線圈(直徑25 mm)。動物清醒狀態(tài)下采取俯臥位，固定于木盒中，兩組動物分別將碟形線圈置于頭部和T6～7椎體處。刺激強度為最大輸出強度的35%，刺激頻率為5 Hz，每序列5 s，間歇2 min，連續(xù)10個序列，1次/ d，下午3點進行，每周5 d，連續(xù)2周。

1.4 行為學(xué)評價

行為學(xué)評價由2名未進行磁刺激的實驗者完成。分別于手術(shù)后第3、10、17、24、31和38天進行BBB評分[9]和水平梯子實驗[10]。BBB評分在直徑95 cm的場地進行。水平梯子實驗使用長度和高度均為1 m的水平梯子，梯子橫梁間隔6 cm，記錄3次大鼠爬過80 cm梯子的正確率，取3次平均值。行為學(xué)評價每天上午9:00進行。

1.5 病理標(biāo)本制作

各組動物術(shù)后第38天取材。10%水合氯醛3.5 ml/ 100 g腹腔麻醉后，給予灌注固定后取脛前肌，快速脫水，低溫石蠟包埋。切取冠狀組織片，切片厚度為6μm，每組織片每隔200μm連續(xù)取5張，分別做免疫組化及陰性對照染色，每個組織塊取5組。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片自然干燥，后續(xù)過程在濕盒中進行。0.01 mmol/L PBS緩沖液沖洗5 min，共3次；0.3% H2O2孵育5 min；0.01 mmol/L緩沖液沖洗5 min，共3次；封閉血清孵育，室溫30 min；傾去封閉血清，滴加兔抗降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)抗體(稀釋度1∶200，50 μl/片)置于4℃冰箱孵育過夜，用0.01 mmol/L PBS替代一抗作為陰性對照；0.01 mmol/LPBS緩沖液沖洗5 min，共3次；生物素標(biāo)記羊抗兔IgG孵育37℃30 min；0.01 mmol/ L PBS緩沖液沖洗5 min，共3次；HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液孵育37℃30 min；0.01 mmol/L PBS緩沖液沖洗5 min，共3次；DAB暗環(huán)境下顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，時間不超過5 min；自來水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。40倍物鏡下每張切片取相互不重疊的5個視野，采用德國LEICA生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計數(shù)CGRP陽性染色標(biāo)記物數(shù)量，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)評價

SCI組、rTMS組和SC-MS組大鼠術(shù)后因失血、感染、腹脹等原因分別死亡2只、3只、4只。

2.1.1 BBB評分

正常對照組大鼠和假手術(shù)組大鼠下肢BBB評分均為21分。手術(shù)后3 d，SCI組、rTMS組和SC-MS組大鼠下肢BBB評分明顯下降，組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。SCI組大鼠術(shù)后17 d下肢運動功能開始有所恢復(fù)，術(shù)后31 d和38 d BBB評分與術(shù)后3 d及10 d BBB評分比較有顯著性差異(P＜0.05)。rTMS組大鼠手術(shù)17 d后各時間點BBB評分與刺激前及SCI組相應(yīng)時間點比較有顯著性差異(P＜0.05)；SC-MS組大鼠BBB評分手術(shù)10 d后各時間點與SCI組相應(yīng)時間點比較有顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

2.1.2 水平梯子實驗

正常對照組、假手術(shù)組大鼠步態(tài)正確率為100%。SCI組、rTMS組和SC-MS組大鼠術(shù)前步態(tài)正確率為100%。SCI組大鼠術(shù)后24 d步態(tài)正確率提高，與術(shù)后3 d和10 d比較有顯著性差異(P＜0.01)。rTMS組大鼠術(shù)后17 d步態(tài)正確率提高，與術(shù)后3 d和10 d比較有顯著性差異；rTMS組手術(shù)17 d后步態(tài)正確率與SCI組相應(yīng)時間點比較提高(P＜0.05)。SC-MS組大鼠步態(tài)正確率術(shù)后10 d即有所提高，與術(shù)后3 d比較有顯著性差異(P＜0.05)；手術(shù)10 d后各時間點步態(tài)正確率與SCI組比較提高(P＜0.05)；術(shù)后10 d和38 d步態(tài)正確率與rTMS組比較也有所提高(P＜0.05)。見表2。

表1 三組各時間點BBB評分

表2 三組各時間點水平梯子實驗步態(tài)正確率(%)

2.2 脛前肌運動終板CGRP蛋白表達

正常對照組和假手術(shù)組脛前肌運動終板可見CGRP免疫組織化學(xué)染色陽性，著色清晰，分布較為均勻。SCI組大鼠脛前肌肌間隙增大，肌肉萎縮，CGRP陽性染色標(biāo)記分布不均勻，部分欠清晰，陽性標(biāo)記數(shù)量(21.00±3.21)與正常對照組(41.16±4.79)和假手術(shù)組(39.50±5.68)相比減少(F=27.808,P=0.000)；rTMS組(35.14±3.33)和SC-MS組(38.50±2.43)運動終板CGRP陽性標(biāo)記數(shù)量與SCI組比較顯著增加(P= 0.000)，rTMS組和SC-MS組比較無顯著性差異(P＞0.05)。見圖1。

3 討論

磁刺激器自1985年由Barker等改進后，臨床主要應(yīng)用于評價運動神經(jīng)傳導(dǎo)功能，并成為對脊髓損傷后手術(shù)、治療、康復(fù)效果進行評價的重要手段[11-12]。在傳統(tǒng)磁刺激器使用過程中，如果多次給予較大刺激強度和刺激頻率的刺激，會導(dǎo)致磁刺激線圈過熱，只得停止給予刺激。近幾年隨著科技的進步，磁刺激線圈不斷改進，風(fēng)冷線圈和水冷線圈的發(fā)明，使得反復(fù)多次給予磁刺激治療能在臨床得以實現(xiàn)。特別是磁刺激可以調(diào)節(jié)深部神經(jīng)的興奮性這一特性，使磁刺激在脊髓損傷康復(fù)中的臨床應(yīng)用和研究有了突破性進展[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)重復(fù)磁刺激對脊髓損傷后運動、呼吸和膀胱直腸功能障礙、痙攣等都有不同程度的治療作用。但是目前大多數(shù)的臨床醫(yī)生和康復(fù)醫(yī)生尚不了解磁刺激這一治療技術(shù)。關(guān)于磁刺激治療改善脊髓損傷后運動功能的有效刺激部位、刺激頻率、治療時間窗等都缺乏統(tǒng)一認(rèn)識，因而極大影響磁刺激在脊髓損傷康復(fù)中的臨床應(yīng)用。

圖1 各組大鼠脛前肌運動終板CGRP蛋白表達(400×)

以往關(guān)于重復(fù)磁刺激治療脊髓損傷后運動功能障礙的臨床和基礎(chǔ)研究多是給予經(jīng)顱磁刺激治療。Belci等臨床研究應(yīng)用rTMS治療不完全性脊髓損傷患者，發(fā)現(xiàn)治療后患者皮層抑制程度下降，手掌魚際肌肌電圖刺激閾值下降，ASIA運動和感覺評分增加，完成9孔木釘擺放時間縮短，隨訪3周上述指標(biāo)仍有改善[4]。Mori等研究發(fā)現(xiàn)，高頻經(jīng)顱磁刺激(5 Hz)可通過增加皮質(zhì)脊髓束興奮性，降低H反射波幅，降低多發(fā)性硬化患者肌張力[13]。動物研究發(fā)現(xiàn)，rTMS對低位脊髓損傷大鼠的運動功能恢復(fù)好于高位脊髓損傷大鼠，并認(rèn)為經(jīng)顱磁刺激對低位脊髓損傷大鼠的治療作用可能與激活中樞模式發(fā)生器有關(guān)[9]。研究者還提出高位脊髓損傷大鼠運動功能恢復(fù)不佳可能與磁刺激線圈大有關(guān)，并推測磁場可能對損傷脊髓造成不良作用，但未獲得直接的實驗證據(jù)。Ahemd等報道脊髓半橫斷大鼠傷后早期在脊髓損傷部位給予15 Hz磁刺激治療及技巧訓(xùn)練，運動功能的恢復(fù)低于脊髓損傷組大鼠，但給予1 Hz磁刺激治療和技巧訓(xùn)練的大鼠運動功能恢復(fù)明顯提高，并提出脊髓損傷后超早期高頻磁刺激可能加重?fù)p傷脊髓局部的繼發(fā)反應(yīng)，而1 Hz低頻磁刺激和技能訓(xùn)練的聯(lián)合治療可能減輕繼發(fā)反應(yīng)，從而促進大鼠運動功能提高，但單純應(yīng)用1 Hz磁刺激治療損傷脊髓不能獲得滿意的運動功能恢復(fù)[14]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)脊髓半橫斷大鼠傷后4 d給予10 Hz經(jīng)顱磁刺激治療運動功能的恢復(fù)明顯好于傷后17 d治療組。這些研究結(jié)果提示，決定磁刺激治療效果的關(guān)鍵因素是刺激頻率、刺激部位及治療時間窗的選擇。

本研究采用5 Hz的經(jīng)顱磁刺激和經(jīng)脊髓磁刺激，在大鼠脊髓半橫斷后4 d開始治療，經(jīng)脊髓磁刺激線圈定位在損傷脊髓以上4個節(jié)段處。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 Hz經(jīng)顱磁刺激組大鼠術(shù)后17 d運動功能(BBB評分和水平梯子實驗踏步正確率)比治療前和SCI組大鼠明顯提高。5 Hz經(jīng)脊髓磁刺激組大鼠術(shù)后10 d BBB評分和水平梯子實驗踏步正確率即有所提高，與治療前、SCI組大鼠和經(jīng)顱磁刺激組大鼠比較差異顯著。這一研究結(jié)果似乎與Poirrier[9]和Ahmed[14]的研究結(jié)果不相一致。Ahemd認(rèn)為，15 Hz高頻磁刺激可能使損傷脊髓產(chǎn)生過度興奮作用，加重脊髓損傷后的繼發(fā)性毒性反應(yīng)，并推測高頻磁刺激可能在脊髓損傷慢性期或恢復(fù)期使用會有效。本研究將經(jīng)脊髓磁刺激線圈放置于損傷脊髓以上4個節(jié)段，可避免直接刺激損傷脊髓，還可以刺激脊髓發(fā)出的神經(jīng)根，從而促進大鼠運動功能恢復(fù)。另外本研究選擇刺激頻率為5 Hz，一方面考慮較大刺激頻率(如≥15 Hz)在脊髓損傷早期會加重繼發(fā)性毒性反應(yīng)，另一方面考慮已有研究證實5 Hz磁刺激即可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮性提高運動功能或降低肌張力[12-13]。

磁刺激對運動功能的作用機制尚不清楚。動物實驗發(fā)現(xiàn)rTMS可以提高環(huán)磷酸腺苷水平和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達[15-16]。張新等觀察到rTMS使脊髓損傷大鼠脊髓生長相關(guān)蛋白-43和5-羥色胺水平上調(diào)，提出磁刺激可能促進軸突生長錐的可塑性變化[17]。除了磁刺激對神經(jīng)可塑性的影響，動物研究還發(fā)現(xiàn)磁刺激可促進動物下肢肌肉萎縮的改善[18]。本研究觀察了各組大鼠脛前肌運動終板CGRP的表達。CGRP是一種神經(jīng)肽類物質(zhì)，在脊髓神經(jīng)元和運動終板中均有分布，在運動終板中與乙酰膽堿共同參與調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉的活動。當(dāng)肌肉出現(xiàn)萎縮或改善時，CGRP會隨之發(fā)生變化，是反映運動終板退變程度較為敏感的指標(biāo)[19]。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)經(jīng)顱和經(jīng)脊髓磁刺激組大鼠脛前肌運動終板CGRP表達增加，提示磁刺激可能通過神經(jīng)興奮性調(diào)節(jié)改變遠端肌肉的可塑性，從而促進運動功能的恢復(fù)。

早期經(jīng)顱和經(jīng)脊髓磁刺激可促進脊髓半橫斷大鼠運動功能改善，并改變遠端肌肉的可塑性，經(jīng)脊髓磁刺激可加快脊髓半橫斷大鼠運動功能恢復(fù)速度。

[1]Dunlop SA.Activity-dependent plasticity:implications for recovery after spinal cord injury[J].Trends Neurosci,2008,31 (8):410-418.

[2]Edgerton VR,Roy RR.Robotic training and spinal cord plasticity[J].Brain Res Bull,2009,78(1):4-12.

[3]Xiong GX,Zhang JW,Hong Y,et al.Motor unit number estimation of the tibialis anterior muscle in spinal cord injury[J]. Spinal Cord,2008,46(10):696-702.

[4]Belci M,Catley M,Husain M,et al.Magnetic brain stimulation can improve clinical outcome in incomplete spinal cord injured patients[J].Spinal Cord,2004,42(7):417-419.

[5]Centonze D,Koch G,Versace V,et al.Repetitive transcranial magnetic stimulation of the motor cortex ameliorates spasticity in multiple sclerosis[J].Neurology,2007,68(13):1045-1050.

[6]Nakatani-Enomoto S,Hanajima R,Hamada M,et al.Bidirectional modulation of sensory cortical excitability by quadripulse transcranial magnetic stimulation(QPS)in humans[J]. Clin Neurophysiol,2012,123(7):1415-1421.

[7]Yip CW,Cheong PW,Green A,et al.A prospective pilot study of repetitive transcranial magnetic stimulation for gait dysfunction in Vascular Parkinsonism[J].Clin Neurol Neurosurg, 2012,S0303-8467(12):00471-00474.

[8]Munoz-Marron E,Redolar-Ripoll D,Zulaica-Cardoso A.New therapeutic approaches in the treatment of neglect:transcranial magnetic stimulation[J].Rev Neurol,2012,55(5):297-305.

[9]Poirrier AL,Nyssen Y,Scholtes F,et al.Repetitive transcranial magnetic stimulation improves open field locomotor recovery after low but not high thoracic spinal cord compression-injury in adult rats[J].J Neurosci Res,2004,75(2):253-261.

[10]Li Y,Oskouian RJ,Day YJ,et al.Optimization of a mouse locomotor rating system to evaluate compression-induced spinal cord injury:correlation of locomotor and morphological injury indices[J].J Neurosurg Spine,2006,4:165-173.

[11]Ellaway PH,Catley M,Davey NJ,et al.Review of physiological motor outcome measures in spinal cord injury using transcranial magnetic stimulation and spinal reflexes[J].J Rehabil Res Dev,2007,44(1):69-76.

[12]Kuppuswamy A,Balasubramaniam AV,Maksimovic R,et al. Action of 5 Hz repetitive transcranial magnetic stimulation on sensory,motor and autonomic function in human spinal cord injury[J].Clin Neurophysiol,2011,122(12):2452-2461.

[13]Mori F,Koch G,Foti C,et al.The use of repetitive transcranial magnetic stimulation(rTMS)for the treatment of spasticity[J].Prog Brain Res,2009,175:429-439.

[14]Ahmed Z,Wagdy M,Benjamin M,et al.Therapeutic effects of acrobatic exercise and magnetic field exposure on functional recovery after spinal cord injury in mice[J].Bioelectromagnetics,2011,32(1):49-57.

[15]Hogan MV,Wieraszko A.An increase in cAMP concentration in mouse hippocampal slices exposed to low frequenc and pulsed magnetc fields[J].Neurosci Lett,2004,366:43-47.

[16]Muller D,Djebbara-Hannas Z,Jourdain P,et al.Brain-derived neurotrophic factor restores long-term potentiation in polysialic acid neural cell adhesion molecule-deficient hippocampus[J].Pro NatlAcad Sci,2000,97:4315-4320.

[17]張新,李建軍,霍小林,等.重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對脊髓運動功能恢復(fù)的影響及其機制的實驗研究[J].中國康復(fù)理論與實踐, 2008,14(3):228-230.

[18]Shimada Y,Sakuraba T,Matsunaga T,et al.Effects of therapeutic magnetic stimulation on acute muscle atrophy in rats after hindlimb suspension[J].Biomed Res,2006,27(1):23-27.

[19]Sato T,Shimizu Y,Kano M,et al.Increase of CGRP expression in motor endplates within fore and hind limb muscles of the degenerating muscle mouse(Scn8a(dmu))[J].Cell Mol Neurobiol,2011,31(1):155-161.

Effects of Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation and Magnetic Stimulation over Spinal Cord on Motor Function Recovery after Spinal Cord Hemisection in Rats

PAN Yu,WANG Xuan,LIU Ping,et al.Department of Rehabilitation,Beijing Rehabilitation Center,Beijing,100144,China

ObjectiveTo observe the effect of repetitive transcranial magnetic stimulation(rTMS)and functional magnetic stimulation over spinal cord(SC-MS)on motor function recovery after spinal cord hemisection in rats.MethodsT10spinal cord hemisection model was made.The stimulation(5×10 s bursts of 5 Hz at 35%maximal stimulator output,each burst separated by a 2 m interval)was delivered daily, 5 d per week for 2 weeks.The treatment began at 4 d after surgery for rTMS group and SC-MS group.Motor function recovery was assessed with Basso,Beattie&Bresnahan locomotor rating scale(BBB)and the Horizontal Ladder test.The tibialis anterior was surgically removed at 38 d after spinal cord injury for calcitonin gene-related peptide(CGRP)iummunohistochemical staining.ResultsThe scores of BBB and Horizontal Ladder test were significantly more at 17 d after spinal cord hemisection in rTMS group than before treatment and in spinal cord injury group(P＜0.05).In SC-MS group,the scores of BBB and Horizontal Ladder Test were significantly more 10 d after SCI than before treatment and in SCI group(P＜0.05).The score of Horizontal Ladder test of SC-MS group was more 10 d after SCI than that in the rTMS gourp(P＜0.05).The expression of CGRP on motor endplates of the tibialis anterior in rTMS group and SC-MS group were more than those of SCI group(P＜0.01).ConclusionrTMS and SC-MS in acute stage can improve the motor function recovery and muscle plasticity after spinal cord hemisection in rats.The magnetic stimulation can facilitate the recovery of motor function after spinal cord hemisection in rats.

repetitive transcranial magnetic stimulation;magnetic stimulation over spinal cord;spinal cord hemisection;motor function;recovery;rats

R651.2

A

1006-9771(2013)04-0324-05

2012-10-30)

1.北京市自然科學(xué)基金(No.7123216)；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)臨床合作課題(No.2007JL12)。

1.北京康復(fù)中心康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京市100144；2.首都醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系，北京市100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，a：神經(jīng)外科，b：中心實驗室，北京市100053。作者簡介：潘鈺(1973-)，女，遼寧沈陽市人，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：脊髓損傷康復(fù)。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.04.003