咯利普蘭治療大鼠脊髓橫斷損傷的實驗研究①

李鋒濤，程斌，李浩鵬，臧全金，張廷，賀西京

·基礎研究·

咯利普蘭治療大鼠脊髓橫斷損傷的實驗研究①

李鋒濤1a，程斌1b，李浩鵬1a，臧全金1a，張廷1a，賀西京1a

目的 探索咯利普蘭治療大鼠脊髓橫斷損傷的可行性。方法取健康成年雌性Sprague-Dawley大鼠30只，隨機分為假手術組(Sham組)、損傷組(SCI組)、咯利普蘭治療組(R組)，每組10只。R組建立大鼠脊髓橫斷損傷模型后立刻皮下注射咯利普蘭；Sham組僅打開椎板；SCI組及Sham組皮下注射相同體積二甲基亞砜(DMSO)。于損傷后2、4、6、8周采用BBB評分法觀察大鼠后肢運動功能情況，損傷后2周時應用免疫組織化學染色檢測各組生長相關蛋白-43(GAP-43)及膠質細胞酸性蛋白(GFAP)的表達。結果損傷后6周、8周時，R組BBB評分優于SCI組(P＜0.05)。損傷后2周，R組GAP-43表達高于SCI組(P＜0.05)，GFAP表達量低于SCI組(P＜0.05)。結論咯利普蘭能提高大鼠脊髓橫斷損傷神經功能評分，提高GAP-43表達，抑制GFAP表達。

脊髓損傷；咯利普蘭；運動功能；生長相關蛋白43；膠質細胞酸性蛋白；大鼠

[本文著錄格式]李鋒濤，程斌，李浩鵬，等.咯利普蘭治療大鼠脊髓橫斷損傷的實驗研究[J].中國康復理論與實踐,2013,19 (7):628-630.

研究發現，提高神經元胞體內環磷酸腺苷(cAMP)的含量，可促進脊髓背根神經節損傷后新生軸突在抑制性環境中的生長[1]。咯利普蘭(rolipram)是第一代磷酸二酯酶Ⅳ(PDEⅣ)特異性抑制劑，可通過特異性抑制PDEⅣ對細胞內cAMP的水解作用，提高細胞內cAMP含量，發揮多種生理作用，如抗炎、免疫調節、抑制凋亡等。本實驗觀察咯利普蘭對大鼠脊髓橫斷損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

生長相關蛋白-43(growth associated protein 43, GAP-43)及膠質細胞酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗體：北京博奧森生物技術有限公司；咯利普蘭：美國SIGMA公司；圖像信號采集與分析系統：德國LEICA公司。

1.2 動物分組及造模

成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠30只，體重(225±23)g，購買于西安交通大學醫學院動物實驗中心，清潔級。將實驗動物隨機分為假手術組(Sham組，n=10)、損傷對照組(SCI組，n=10)、咯利普蘭治療組(R組，n=10)。

所有動物術前禁食過夜，自由飲水。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉。將動物固定在手術臺上，常規消毒，以T9為中心取背側正中切口，切除T9、T10全椎板，暴露脊髓組織。找出T9、T10椎間盤，從脊髓一側用小圓針0號絲線穿過T9、T10椎間盤組織，并從另一側出來，于絲線頭側1 mm(T9水平)處橫向切斷脊髓組織及部分椎間盤，無阻力提出預置線，確保脊髓組織完全橫斷。7-0無損傷線縫合損傷區兩側的硬脊膜，棉簽壓迫止血，生理鹽水沖洗傷口；依次縫合傷口。Sham組僅打開椎板暴露脊髓，不損傷脊髓。術后每日人工膀胱按摩2次，直至膀胱排尿反射恢復。術后3只大鼠因泌尿系感染死亡，其中R組1只，SCI組2只，均按相同條件予以補充。

1.3 治療方法

將咯利普蘭溶于二甲基亞砜(DMSO)中。R組于建模后立即皮下注射0.5 mg/kg·d，分4次注射，共10 d。其余各組按相同方法于皮下注射同體積DMSO。

1.4 檢測指標

1.4.1 大鼠后肢運動功能評分 采用雙人雙盲取平均值的方法，按照BBB評分法分別于損傷后2、4、6、8周對各組動物的后肢運動功能進行評分。

1.4.2 免疫組織化學染色 損傷后2周時處死動物(每組5只)，4%多聚甲醛灌注，取出T9節段脊髓，石蠟包埋，于損傷頭尾側2 mm范圍內連續切片，厚10 μm。按照試劑盒操作步驟分別進行GAP-43及GFAP免疫組織化學染色。應用LEICA Q500IW圖像信號采集與分析系統進行圖像采集處理。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 后肢運動功能評分

損傷后2周時，除Sham組外，其他各組動物后肢BBB評分為0分；4周時，后肢運動功能有輕微恢復，R組與SCI組之間無顯著性差異(t=1.13,P＞0.05)；6周、8周時，R組與SCI組間有顯著性差異(t=2.34,P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠后肢神經BBB評分比較

2.2 免疫組織化學染色

2.2.1 GAP-43 Sham組有少量GAP-43蛋白表達于神經元胞漿中。各損傷組動物脊髓組織中GAP-43蛋白表達較Sham組明顯增加，以R組表達量最多。見圖1、表2。

2.2.2 GFAP Sham組有少量GFAP陽性膠質細胞散在分布于灰質和白質中。SCI組GFAP陽性膠質細胞大量增生，排列不整，形成明顯的瘢痕組織。R組較SCI組GFAP陽性膠質細胞著色較淺，數量較少。見圖2、表2。

表2 各組GFAP及GAP-43表達比較(平均灰度值)

圖1 各組治療后2周GAP-43表達(免疫組織化學染色，400×)

圖2 各組治療后2周GFAP表達(免疫組織化學染色，400×)

3 討論

SCI后軸突再生失敗的原因主要有兩個：損傷后中樞神經系統內的抑制性因素，如NogoA、髓鞘相關糖蛋白(MAG)和少突膠質細胞髓鞘糖蛋白(OMgp)等的抑制作用，以及有限的軸突再生能力(局部神經細胞的大量壞死和凋亡、神經營養因子的缺乏等)。雖然損傷區殘存的軸突可發芽生長較短距離[2]，但這些再生的軸突生長錐由于缺乏神經營養因子的支持，以及受到髓鞘抑制性分子、膠質瘢痕的化學性和物理性抑制等，很快發生萎縮[3-4]，不能形成較長距離的新生軸突穿出損傷區與靶細胞發生突觸連接，使再生失敗。

研究發現，提高神經元胞體內cAMP的含量，可促進脊髓背根神經節損傷后新生軸突在抑制性環境中的生長[1]。細胞內cAMP含量的升高，激活蛋白激酶A(PKA)和絲裂原激活蛋白激酶(MEK)/細胞外信號調節激酶(ERK)信號通路，使轉錄因子cAMP效應元件結合蛋白(CREB)發生磷酸化而被活化。活化的CREB可引起相關基因的轉錄，促使新生軸突抵抗MAG和髓鞘的抑制而再生。

咯利普蘭可通過抑制細胞內PDEⅣ，減少cAMP的水解，引起多種生物學功能：①減少前炎性因子白細胞介素(IL)-13、IL-5、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素(IFN-γ)的表達，減輕炎癥反應；②降低血腦屏障的通透性，減少炎性細胞及有害因子穿過血腦屏障引起的組織損傷；③降低誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達，減少一氧化氮(NO)等超氧化合物的生成[5]；④激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，抑制促凋亡蛋白Bad和caspase-3的活化，同時使Bcl-2磷酸化而被激活，從而減少細胞凋亡；⑤促進中樞神經損傷后新生軸突克服抑制性分子如Nogo、MAG和OMgp的抑制而生長。此外，咯利普蘭還可阻止Ca2+內流，減少Ca2+介導的死亡通路，抑制損傷區軸突脫髓鞘作用。Antonio等應用咯利普蘭治療大鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)，可明顯抑制EAE動物脊髓和淋巴結內基質金屬蛋白酶(MMP-9)基因的轉錄，降低核因子(NF-κB)的表達水平，抑制炎性細胞因子的合成[6]。Folcik等發現，咯利普蘭可降低大鼠中樞神經系統血管內皮通透性，阻止炎性細胞的侵潤，減輕組織水腫[7]。Nikulina等發現，咯利普蘭在體外可克服MAG或者髓鞘對神經元的抑制作用，促進軸突的生長[8]。

本研究顯示，咯利普蘭能改善大鼠脊髓橫斷損傷后的神經運動功能，提高GAP-43的表達，抑制GFAP的合成，提示抑制星形膠質細胞的增生，為神經軸突生長提供一定的條件。

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Effects of Rolipram on Spinal Cord Transection Injury in Rats

LI Feng-tаo,CHENG Bin,LI Hаo-peng,et аl.Depаrtment of Orthopedics,the Second Hospitаl of Xi'аn Jiаotong University,Xi'аn 710004,Shааnxi,Chinа

ObjectiveTo investigate the possibility of rolipram for treatment of spinal cord injury(SCI)in rats.Methods30 adult female Sprague-Dawley rats were divided into sham-operation group(sham group,n=10),spinal cord injury group(SCI group,n=10)and rolipram treatment group(R group,n=10).The rats in SCI group and R group were modeled as spinal cord transection injury,and R group was administrated with rolipram subcutaneouly after SCI.They were assessed with Basso Beattie and Bresnahan(BBB)score 2,4,6,and 8 weeks after SCI,and the expressions of growth associated protein 43(GAP-43)and glial fibrillary acidic protein(GFAP)were detected with immunohistochemistry 2 weeks after SCI.ResultsThere were significant difference in the BBB scores between SCI and R groups 6 and 8 weeks after SCI(P＜0.05).The expression of GAP-43 was more and GFAP was less in R group than in SCI group(P＜0.05).ConclusionRolipram can increase the expression of GAP-43 and inhibit the expression of GFAP,while improves the the motor function in rats after spinal cord transsection injury.

spinal cord injury;rolipram;motor function;growth associated protein 43;glial fibrillary acidic protein;rats

R681.2

A

1006-9771(2013)07-0628-03

2012-07-19

2012-11-28)

1.西安交通大學第二附屬醫院，a.骨二科；b.骨三科，陜西西安市710004。作者簡介：李鋒濤(1980-)，男，陜西興平市人，博士，主治醫師，主要研究方向：脊柱外科。通訊作者：賀西京，教授，博士生導師，主要研究方向：脊柱外科。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.07.009