臭氧和負離子對鐮刀菌M4抑制作用及其機理的初步研究

臭氧和負離子對鐮刀菌M4抑制作用及其機理的初步研究

李慧1，黃思1，RASULOV FARRUHBEK2，齊小保1，嚴守雷1，王清章1，李潔1
（1.華中農業大學食品科學技術學院，武漢，430070；2.Tashkent Chemical Technological Institute）

為了探究臭氧和負離子對蓮藕采后主要腐敗菌-鐮刀菌M4的生長及細胞壁、細胞膜的影響，本試驗對處于穩定期的鐮刀菌M4分別進行不同條件的臭氧和負離子處理，通過測定抑菌率、細胞壁和細胞膜通透性初步研究臭氧和負離子對鐮刀菌M4的抑制作用及其機理。結果顯示，臭氧、負離子對鐮刀菌M4均有較強的抑制作用,抑菌率與處理時間成正相關；臭氧和負離子之間具有協同作用；臭氧+負離子處理對鐮刀菌M4的細胞壁和細胞膜均有顯著的破壞作用，破壞程度隨處理時間的延長而增加；處理前期主要是電解質的滲出，處理2 h及以上時核酸和蛋白質等大分子物質開始滲出。

鐮刀菌M4；臭氧；負離子；抑菌率；細胞壁；細胞膜；通透性

臭氧在常溫下是一種不穩定的淡藍色氣體，有特殊的刺激味。由于臭氧的強氧化性和廣譜性，因而具有消毒、殺菌、除臭、防霉、保鮮等功能[4]，其殺菌能力僅次于氟，是氯的3倍，殺菌速度極快，是氯的500～3 000倍[5]。一般認為，臭氧殺滅細菌、霉菌類微生物是通過作用于細胞膜，使細胞膜構成受到損害，導致新陳代謝障礙并抑制其生長，進而繼續滲透破壞膜內組織，直至細胞死亡[6]。又由于臭氧使用方便、刺激性小、作用快速、無殘留污染等優點，被廣泛應用于食品保鮮與加工等領域[7]。

負離子是帶負電的原子或基團[6]。氣體放電過程中產生的負離子具有較高的活性，且有很強的氧化還原作用，能破壞細菌的細胞膜或細胞原生質活性酶的活性，在果蔬保鮮中可以起到抗菌殺菌的目的[8]。同時，負離子還可以分解內源乙烯，鈍化酶活性，降低呼吸強度，從而減緩營養物質在貯藏期間的轉化。

目前國內對臭氧和負離子的研究多集中于應用保鮮方面，對其抑菌機理報道較少。本試驗通過測定抑菌率、細胞壁和細胞膜通透性變化，對臭氧、負離子抑制鐮刀菌M4的作用及其機理做了初步探究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

②試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 （PDA）由國藥集團化學試劑有限公司生產。

③儀器設備 MIC-03臭氧變送器由深圳市藍月測控技術有限公司生產；XA-1負離子發生器、DDS-11A電導率儀由上海雷磁儀器廠生產；722N分光光度計由上海精密科學儀器有限公司生產；J-E超速冷凍離心機由美國Beckman Coulter Inc生產。

1.2 試驗方法

①抑菌率的測定 將鐮刀菌在PDA培養基上培養6 d后，在菌落邊緣打出直徑6 mm的菌餅，移至PDA平板中央，然后將打開蓋子的平板立即放入密閉有機玻璃箱中進行以下處理 （溫度25℃，濕度50%）：A.臭氧（3 500 mg/m3）、B.負離子（106ions/cm3）、C.臭氧+負離子（臭氧3 500 mg/m3+106ions/cm3），分別處理1，2，3，4 h。每個處理重復3皿，置于25℃下培養3 d，用十字交叉法測定其菌落擴展直徑，并計算抑菌率。以不做任何處理的培養基為對照。用抑菌率表示其對鐮刀菌M4的抑制效果。

抑菌率（%）=[（對照菌落的平均直徑-處理菌落的平均直徑）/對照菌落的平均直徑]×100%

②對菌體細胞壁的影響 選取C處理的菌餅于PDB培養基中培養，取培養3 d后的菌液，同時不做處理的作為對照組，4℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液用分光光度計于510 nm處測定吸光值[9]。

③對菌體細胞膜通透性的影響a.對電導率的影響。選取C處理的菌餅于PDB培養基中培養，取培養3 d后的菌液，同時以不做處理組作為對照，4℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液用電導率儀測定電導率，確定金屬離子的滲出變化趨勢[10]。

b.對大分子內含物滲出的影響。選取C處理的菌餅于PDB培養基中培養，取培養3 d后的菌液，同時以不做處理組作為對照，置于超速冷凍離心機中4℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液分別于260 nm和280 nm處測定吸光值[11]。

2 結果與分析

2.1 不同處理條件對鐮刀菌的抑制作用

從圖1可知，在臭氧 （3 500 mg/m3）、負離子（106ions/cm3）、臭氧+負離子（臭氧3 500 mg/m3+ 106ions/cm3）3種不同處理條件下，抑菌率與處理時間均呈正相關，處理時間越長，抑菌效果越好；且臭氧+負離子處理的抑菌效果均優于臭氧、負離子單獨處理，說明臭氧和負離子處理之間具有協同作用，這對于提高鐮刀菌生長抑制率具有重要意義。方差分析顯示，同一處理時間，3種處理間差異極顯著（＜0.01），每種處理中不同處理時間差異極顯著（＜0.01）。

2.2 臭氧+負離子對菌體細胞壁通透性的影響

堿性磷酸酶位于細胞的細胞壁和細胞膜的間隙之中，在正常情況下不向外分泌，只有當細胞壁的通透性增大后，堿性磷酸酶才會釋放到細胞體外[10]。由圖2結合顯著性分析可知，處理組與對照組相比，堿性磷酸酶的溶出量顯著增加（＜0.05），且隨著處理時間的延長，兩兩之間均有顯著差異（＜0.05）。由此說明，臭氧+負離子處理對細胞壁的破壞作用顯著，導致其通透性顯著變化，且處理的時間越長，對細胞壁的破壞效果越顯著。

2.3 臭氧+負離子處理對細胞膜通透性的影響

①臭氧+負離子處理對電導率的影響 由圖3可知，處理組鐮刀菌M4培養液的電導率顯著高于對照組（＜0.05），且隨著處理時間的延長，電導率增大，兩兩之間具有顯著差異（＜0.05），說明臭氧+負離子處理的菌體細胞隨著作用時間的延長，電解質的滲出量不斷增大，細胞膜被破壞。

圖1 不同處理條件下的抑菌率

圖2 臭氧+負離子處理對菌體細胞壁通透性的影響

圖3 臭氧+負離子處理對電導率的影響

②臭氧+負離子處理對大分子內含物滲出的影響 細胞膜的通透性是反映細胞膜完整性的一部分，當真菌細胞膜被破壞后，細胞內的小分子物質首先外泄出來，接著是大分子物質如核酸和蛋白質[2]。為進一步反映臭氧+負離子處理對細胞膜完整性的影響，可以測定滲透到細胞外的核酸和蛋白質的含量。核酸、蛋白質分別在260 nm、280 nm處有最大吸收峰，對260 nm和280 nm吸收物質的檢測被廣泛應用于測定細胞膜的完整性[12]。

由圖4結合顯著性分析可知，與對照組相比，臭氧+負離子處理1 h，細胞外液核酸和蛋白質的含量沒有顯著變化（＞0.05）；臭氧+負離子處理2 h及以上組細胞外液核酸和蛋白質的含量顯著增加（＜0.05），且隨著時間的延長，吸光值數值增大，處理2 h及以上組細胞外液核酸和蛋白質的含量隨時間延長均有顯著差異（＜0.05），尤其在處理3 h后差異顯著增大。由此說明，臭氧+負離子處理逐步導致鐮刀菌M4大分子內含物滲出，且隨處理時間延長，這種效應逐漸增大。

綜合圖3和4分析可知，臭氧+負離子處理對鐮刀菌M4的細胞膜有顯著的破壞作用，破壞程度隨處理時間的延長而增加，處理前1 h主要導致小分子電解質滲出，致使細胞外液電導率顯著增加，當處理時間延長至2 h及以上時，核酸和蛋白質等大分子物質才透過細胞膜，滲透到菌體外，處理3 h后核酸和蛋白質等大分子物質開始快速滲出。

3 結論與討論

本試驗初步研究了臭氧、負離子對鐮刀菌M4的抑菌作用及其機理，結果表明臭氧、負離子對蓮藕采后病原菌鐮刀菌M4均有較強的抑制作用，抑菌率與處理時間呈正相關；臭氧和負離子之間具有協同作用；臭氧+負離子處理對鐮刀菌M4的細胞壁和細胞膜均有顯著的破壞作用，破壞程度隨處理時間的延長而增加；處理前期主要是電解質的滲出，處理2 h及以上時核酸和蛋白質等大分子物質開始滲出。可能正是臭氧+負離子處理對細胞壁和細胞膜的這種逐步破壞，導致其通透性增加，細胞內物質外流，影響菌體新陳代謝和生命活動，從而達到對鐮刀菌M4的抑制效果。

圖4 臭氧+負離子處理對核酸（A）和蛋白質（B）滲出的影響

[1]Busarakom M,Patchimapom U,Marcus N,et al.Effects of pretreatments on coloralterations of litchi during drying and storage[J].European Food Research and Technology,2009, 229(2):329-337.

[2]Jiang T J,Luo S S,Chen Q P,et al.Effect of integrated application of gamma irradiation and modified atmosphere packaging on physicochemical and microbiological properties of shiitake mushroom()[J].Food Chemistry,2010,122(3):761-767.

[3]羅海莉，王清章.蓮藕貯藏期病害微生物研究及涂膜保鮮[D].武漢：華中農業大學，2011.

[4]白亞鄉，胡玉才，徐建萍.物理技術在食品貯藏與果蔬保鮮中的應用[J].物理，2003（3）：171-175.

[5]梁運章.靜電生物效應及其應用[J].物理，1995，24（1）：39-42.

[6]瞿晶晶，何正浩.空氣放電葡萄保鮮技術初步研究[D].武漢：華中科技大學，2005.

[7]王文生，石志平，洪霞.空氣放電在果品貯藏保鮮中的應用[J].中國果樹，2002，13（2）：23-26.

[8]金明，宋冠群，趙麗霞.環境、健康與負氧離子[M].北京：化學工業出版社，2006：50-56.

[9]周先漢，張秀喜，等.蜂膠提取物抑菌活性及其抑菌機理的研究[J].食品科技，2009，34（5）:233-236.

[10]宋磊.BIT對灰霉菌的抑制作用及機理[D].西安：西北大學，2010.

[11]Baez-Sanudo M,Siller J.Extending the shelf-life of bananas with1-methylcyclopropeneand a chitosan-based edible coating[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2009,89(14):2 343-2 349.

[12]高偉，田黎，周俊英，等.海洋芽孢桿菌（） B29987菌株抑制病原真菌機理[J].微生物學報，2009（11）：1 494-1 501.

Inhibition Effects and Mechanism of Ozone and Anion on Fusarium M4

LI Hui1,HUANG Si1,RASULOV FARRUHBEK2,QI Xiaobao1, YAN Shoulei1,WANG Qingzhang1,LI Jie1

We determined the inhibition rate and permeability of cytoderm and cytomembrane of Fusarium M4 with different densities of ozone and gas-phase anion,to study the inhibition effects and mechanism of ozone and anion on Fusarium M4 which caused rhizome rot of lotus root.The results showed that,both the ozone treatment and the gas-phase anion treatment had stronger inhibitory effects on Fusarium M4,and the inhibition rates were positively correlated with processing time. Ozone and gas-phase anion had a synergistic effect on inhibiting Fusarium M4,and the treatment ozone+gas-phase anion damaged the cytoderm and cytomembrane of Fusarium M4 dramatically,moreover the damage aggravated as the processing time prolonged.The electrolyte mainly leaked at earlier stage,and macromolecules such as nucleic acids and proteins began to leak after being treated by two hours.

Fusarium M4;Ozone;Anion;Inhibition rate;Cytoderm;Cytomembrane;Permeability

S182

：A

：1001-3547（2013）18-0098-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2013.18.031

中央高校基本科研業務費專項資金資助（項目批準號2011JC024）

李慧（1989-），女，碩士，研究方向為農產品貯藏加工質量與安全

李潔（1976-），女，通信作者，副教授，碩士研究生導師，研究方向農產品貯藏加工質量與安全，電話:18071090408，E-mail:lijie1976@mail.hzau.edu.cn

2013-07-30