酒精性癡呆大鼠海馬神經細胞凋亡與氧化應激的研究

楊海玉，吳曉牧，劉 勇，曾玉娥

慢性酒精中毒對于人類健康的危害日趨嚴重。酒精性癡呆(alcohol-associated dementia，AAD)是指由于長期飲酒導致慢性腦器質性損害而出現記憶缺損并伴有一種或一種以上認知功能受損的精神行為異常，同時可伴有震顫、譫妄、痙攣發作等神經功能障礙，記憶受損是其最重要和最基本的特征［1］。研究結果顯示慢性酒精中毒已成為誘導癡呆發病的重要因素，AAD 患者可占癡呆發病人群的21%～24%［2］。由于其治療手段有限且治療效果不佳，大多數AAD 患者不能完全恢復至正常。因此，深入研究酒精誘導學習記憶功能損害的機制，對于尋求更為有效的AAD 治療方法具有十分重要的意義。研究認為海馬具有特殊的神經結構基礎，是調控學習記憶功能的關鍵腦區。目前研究表明酒精誘導海馬損傷的機制較為復雜，可從神經細胞、突觸可塑性以及學習記憶相關分子等多方面對學習記憶功能造成損害［3］。本研究通過建立酒精性癡呆大鼠模型，以大鼠Morris 水迷宮(Morris water maze，MWM)行為學檢測評價其學習記憶功能，并且觀察大鼠海馬神經細胞凋亡狀況以及血清氧化應激指標的變化，探討其與酒精誘導學習記憶功能損害的關系。

1 材料與方法

1.1 AAD 大鼠模型的建立

采用8 周齡雄性SD 大鼠(180～220g)(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。按完全隨機區組法將動物分為生理鹽水組(n=6)和酒精組(n=8)。酒精組大鼠給予持續酒精灌胃(20%，8ml/kg)28d，每天1 次。生理鹽水組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2 MWM 行為學檢測［4］

檢測動物從入水至尋找到平臺的時間，即逃避潛伏期(escape latency，EL)，并以此作為衡量動物學習記憶能力的標準。實驗規定大鼠最長游泳時間為60s，如動物在60s 內找不到平臺，則將其引導至平臺停留20s，記錄該次EL 為60s。所有大鼠在檢測前均接受訓練5d。各組大鼠分別于灌胃前和灌胃28d 后進行MWM 行為學檢測。每只動物以3 次游泳成績(分別從3 個入水點記錄)的平均值作為該動物的EL。

1.3 大鼠海馬神經細胞凋亡檢測

各組大鼠于灌胃28d MWM 行為學檢測結束后處死取腦。選取大鼠海馬區進行組織切片，經脫蠟、水化處理后用PBS 洗3 次，然后每張切片滴加適量Hoechst 33342 染色液(碧云天生物技術研究所)覆蓋組織，避光染色10min，PBS 洗3 次后封片，采用熒光顯微鏡(德國徠卡)20 倍鏡下觀察取圖。每只大鼠各選取1 張切片，每張切片雙側海馬的海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)和CA1區分別隨機選取3個視野，并進行凋亡神經細胞計數。凋亡細胞的特征表現為細胞核呈明顯固縮、濃染。

1.4 氧化應激檢測

各組大鼠處死前取血清放-80℃冰箱凍存備用。實驗方法嚴格按總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)測試盒和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測試盒(南京建成)說明書進行。采用紫外分光光度計分別檢測T-SOD 反應液(550nm)和 GSH-Px 反應液(412nm)的光密度(opticaldensity，OD)值。每個樣品重復檢測3 次，取平均值進行統計學分析。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 MWM 檢測結果

為了評價酒精對大鼠學習記憶功能的影響，我們對各組大鼠進行了MWM 行為學檢測。實驗結果顯示建模前兩組大鼠的EL 時間無明顯差異(P＞0.05);而大鼠在給予酒精灌胃28d 后，與生理鹽水組相比，其EL 時間明顯延長，結果具有統計學顯著差異(P＜0.05)(見表1)。

2.2 海馬神經細胞凋亡檢測結果

如圖1 所示，酒精組大鼠海馬DG 區可見大量聚集分布的異形、致密濃染凋亡細胞(見圖1B，Eth)，而生理鹽水組大鼠海馬DG 區僅見少量濃染凋亡細胞(見圖1A，Con)。凋亡細胞計數結果顯示，與生理鹽水組相比，酒精組大鼠海馬DG 區(16.00±0.89 vs.99.5 0±12.39，cells，P＜0.01)和CA1區(9.50±2.18 vs.35.83±4.45，cells，P＜0.01)中的凋亡神經細胞數量均明顯增加。

圖1 大鼠海馬齒狀回神經細胞凋亡檢測結果

2.3 大鼠血清氧化應激檢測結果

表2 數據顯示與生理鹽水組相比，大鼠給予酒精灌胃28d 后，其血清中GSH-Px 的酶活力明顯抑制，結果有統計學差異(P＜0.01);而T-SOD 的酶活力雖有下降趨勢，但結果無統計學差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠MWM 檢測EL 比較(s)

表2 各組大鼠血清氧化應激指標檢測結果(U/ml)

3 討論

AAD 是慢性酒精中毒最為嚴重的精神病狀態，也是長期大量飲酒引起腦器質性損害的結果，臨床表現記憶力缺損伴其他認知功能障礙為其主要特征。本研究通過持續酒精灌胃28d 建立AAD 大鼠模型，經MWM 行為學檢測證實其EL 時間顯著延長，提示酒精對大鼠學習記憶功能造成損傷。研究認為海馬是調控學習記憶功能的關鍵腦區，在短時記憶轉為長時記憶以及空間航行定位功能中具有重要作用。大量研究證實長期慢性飲酒可促使海馬體積減小及海馬區大量神經細胞凋亡。Oliveira-da-Silva 等［5］對出生后30～45d 的C57BL/6 小鼠給予腹腔注射酒精發現，酒精作用可導致海馬大部分區域(包括齒狀回顆粒層及分子層、CA1、CA2和CA3區)的凋亡細胞數目增加，而且神經元及膠質細胞密度明顯減少。Vongvatcharanon 等［6］對3 月齡雌性成年Wistar 大鼠給予低濃度和高濃度酒精作用3w～0.5y發現，各組大鼠海馬區和扣帶回皮質γ-氨基丁酸能神經元減少和神經小膠質細胞增加，并且這種改變隨著飲酒時間的延長而增加。同樣，本研究也證實了酒精可誘導大鼠海馬區神經細胞發生顯著凋亡。以上結果提示酒精促進海馬神經元凋亡是其導致學習記憶功能損傷的重要機制。

目前研究認為氧化應激是酒精誘導神經元凋亡的重要機制。氧化應激是指由于體內氧化與抗氧化作用失衡，活性氧自由基產生過多而超出機體清除能力，氧自由基可透過細胞膜脂質層與胞膜結構發生反應，進而損傷細胞膜并導致細胞死亡。研究證實長期慢性飲酒可通過抑制抗氧化酶的活性使細胞內氧自由基生成過多，從而造成細胞損傷［7，8］。GSH-Px 是機體內廣泛存在的一種過氧化物分解酶，也是衡量機體抗氧化能力的重要指標之一。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，它能催化GSH 變為GSSG，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的損害。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)也是重要的抗氧化酶之一，廣泛分布于各種生物體內，是機體內清除氧自由基的關鍵酶。Scolaro 等［9］研究發現慢性酒精作用可明顯抑制大鼠海馬及血清中GSH-Px 的酶活力，而對SOD 的酶活力卻有上調作用。在本研究中，我們同樣證實酒精可明顯抑制大鼠血清GSH-Px 的酶活力，但對T-SOD 的作用不明顯，提示酒精對機體抗氧化能力的損傷主要與抑制GSH-Px 功能有關。由此，我們認為，針對性阻斷酒精對GSH-Px 功能的抑制是進一步研究酒精性癡呆治療方法的突破口。

［1］李舜偉.認知功能障礙的診斷與治療［J］.中國神經精神疾病雜志，2006，32(2):189-191.

［2］Smith DM，Atkinson RM.Alcoholism and dementia［J］.Int J Addict，1995，30(13-14):1843-1869.

［3］Alfonso-Loeches S，Guerri C.Molecular and behavioral aspects of the actions of alcohol on the adult and developing brain［J］.Crit Rev Clin Lab Sci，2011，48(1):19-47.

［4］Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］.Nat Protoc，2006，1(2):848-858.

［5］Oliveira-da-Silva A，Manh?es AC，Cristina-Rodrigues F，et al.Hippocampal increased cell death and decreased cell density elicited by nicotine and/or ethanol during adolescence are reversed during drug withdrawal［J］.Neuroscience，2010，167(1):163-173.

［6］Vongvatcharanon U，Mukem S，Udomuksorn W，et al.Alcohol administration during adulthood induces alterations of parvalbumin and glial fibrillary acidic protein immunoreactivity in rat hippocampus and cingulated cortex［J］.Acta Histochem，2009，112(4):392-401.

［7］Zhong Y，Dong G，Luo H，et al.Induction of brain CYP2E1 by chronic ethanol treatment and related oxidative stress in hippocampus，cerebellum，and brainstem［J］.Toxicology，2012，302(2-3):275-284.

［8］Wu D，Cederbaum AI.Oxidative stress mediated toxicity exerted by ethanol-inducible CYP2E1［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2005，207(2 Suppl):70-76.

［9］Scolaro B，Delwing-de Lima D，da Cruz JG，et al.Mate tea prevents oxidative stress in the blood and hippocampus of rats with acute or chronic ethanol administration［J］.Oxid Med Cell Longev，2012，2012(3):314758.