采用誘導(dǎo)分化的SH-SY5Y 細(xì)胞建立酒精性癡呆體外研究模型的探討

楊海玉，劉 勇

慢性酒精中毒對(duì)于人類(lèi)健康的危害日趨嚴(yán)重。大腦是酒精誘導(dǎo)損傷的最常見(jiàn)靶器官之一，長(zhǎng)期大量飲酒可引起腦器質(zhì)性損害，并逐漸發(fā)展至癡呆狀態(tài)，臨床稱(chēng)之為酒精性癡呆(alcohol-associated dementia，AAD)［1］。由于其治療手段有限且治療效果不佳，大多數(shù)AAD 患者不能完全恢復(fù)至正常。酒精屬親脂性小分子化學(xué)物質(zhì)，可迅速通過(guò)血腦屏障和細(xì)胞膜，對(duì)腦組織造成直接損害。目前研究發(fā)現(xiàn)，短暫酒精暴露即可產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，引起神經(jīng)元大量死亡;而長(zhǎng)期酒精接觸可顯著抑制神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及降低細(xì)胞存活率，導(dǎo)致神經(jīng)元分化延緩以及結(jié)構(gòu)破壞［2，3］。但是，關(guān)于這方面的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。由于取材受到來(lái)源以及倫理學(xué)的限制，使用人原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞作為研究對(duì)象困難很大。SH-SY5Y 細(xì)胞又稱(chēng)為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，該細(xì)胞誘導(dǎo)分化后可表現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)特征，目前常用于神經(jīng)元損傷模型的研究［4，5］，具有取材培養(yǎng)方便、易行等優(yōu)勢(shì)。因此，在本研究中我們采用維甲酸(retinoic acid，RA)誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞分化，并通過(guò)給予不同濃度的酒精連續(xù)培養(yǎng)，觀察酒精對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞的損傷作用，為進(jìn)一步研究AAD 的發(fā)病機(jī)制提供簡(jiǎn)單可行的體外研究模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司;RA、四甲基偶氮唑藍(lán)［3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］、碘化丙啶(propidium iodide，PI)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.2 SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化［6］

SH-SY5Y 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM 高糖培養(yǎng)基加入體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，5%CO2、37℃條件培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化傳代。將細(xì)胞按1×104濃度平均接種到96 孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)，換用含體積分?jǐn)?shù)1%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并加入終濃度為10μm 的RA 誘導(dǎo)細(xì)胞分化，每天換液一次，連續(xù)6d，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3 檢測(cè)酒精對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞增殖的影響

本研究采用MTT 比色法檢測(cè)酒精對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響。該細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，于7d 棄去含RA 的培養(yǎng)基，酒精組細(xì)胞分別加入含不同濃度酒精(10～400mol/L)的培養(yǎng)基，對(duì)照組細(xì)胞加入不含酒精的培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24h。之后，每孔加入20μl MTT 溶液(5mg/ml)，37 ℃培養(yǎng)4h。棄去所有溶液后加入200μl DMSO 溶液，振蕩10min，采用酶標(biāo)儀570nm 波長(zhǎng)檢測(cè)光密度(optical density，OD)值，并根據(jù)各組OD 值計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 檢測(cè)酒精對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響

PI 是一種能穿過(guò)破損細(xì)胞膜且與DNA 結(jié)合的熒光染料，散發(fā)紅色熒光，常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)。酒精組細(xì)胞給予酒精(100mol/L)作用24h 后，棄去培養(yǎng)基，用PBS 洗3 次，然后每孔滴加適量PI 染色液覆蓋細(xì)胞，避光染色10min，PBS 洗3 次后采用熒光顯微鏡(型號(hào)DM3000，德國(guó)徠卡公司)觀察取圖。對(duì)照組給予PBS 代替酒精，其余處理同酒精組。凋亡細(xì)胞的特征表現(xiàn)為細(xì)胞核呈明顯固縮、濃染。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SH-SY5Y 細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的形態(tài)觀察

如圖1 所示，未分化的SH-SY5Y 細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)良好(見(jiàn)圖1A);而在使用RA 誘導(dǎo)分化后細(xì)胞胞體增大，有較多細(xì)長(zhǎng)的突起，表現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)特征(見(jiàn)圖1B)。

2.2 酒精對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞增殖的影響

分化后的SH-SY5Y 細(xì)胞經(jīng)不同濃度酒精作用24 h，采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酒精濃度達(dá)到100 mol/L 時(shí)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P＜0.05);并且隨著酒精濃度的增加(100～400mol/L)，細(xì)胞增殖抑制呈濃度依賴(lài)關(guān)系(見(jiàn)圖2)。

圖1 SH-SY5Y 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

圖2 MTT 法檢測(cè)不同濃度酒精對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞增殖的作用

2.3 酒精對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響

如圖3 所示，酒精組(100mol/L)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯，可見(jiàn)大量細(xì)胞表現(xiàn)胞核皺縮、濃染(PI 染色陽(yáng)性)(見(jiàn)圖3B)，而對(duì)照組則少見(jiàn)凋亡細(xì)胞存在(見(jiàn)圖3A)。

圖3 PI 染色檢測(cè)酒精誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡結(jié)果

3 討論

AAD 是慢性酒精中毒最為嚴(yán)重的精神病狀態(tài)，也是長(zhǎng)期大量飲酒引起腦器質(zhì)性損害的結(jié)果，臨床表現(xiàn)記憶力缺損伴其他認(rèn)知功能障礙為其主要特征。研究結(jié)果顯示慢性酒精中毒已成為誘導(dǎo)癡呆發(fā)病的重要因素，AAD 患者可占癡呆發(fā)病人群的21%～24%［7］。目前研究表明慢性酒精中毒導(dǎo)致的腦損害是一個(gè)慢性進(jìn)展性過(guò)程，呈不可逆性并伴有多種病理學(xué)改變。研究證實(shí)慢性酒精中毒患者的特定腦區(qū)可出現(xiàn)選擇性神經(jīng)元或神經(jīng)核團(tuán)丟失、神經(jīng)軸突減少以及復(fù)雜性突觸結(jié)構(gòu)退化等病理變化，其機(jī)制與慢性酒精作用促進(jìn)氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎性反應(yīng)、抑制神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和粘附分子表達(dá)、破壞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及其功能、影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及干擾細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等密切相關(guān)［8～10］。目前有關(guān)酒精與癡呆發(fā)生的關(guān)系及其具體分子機(jī)制仍不十分清楚，因此建立簡(jiǎn)便易行的酒精性癡呆體外研究模型將有助于深入探討這類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制。

SH-SY5Y 細(xì)胞具有神經(jīng)元分化潛能，是目前公認(rèn)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的細(xì)胞模型。本課題以SH-SY5Y 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以RA 為誘導(dǎo)劑，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞分化，進(jìn)一步觀察酒精對(duì)該細(xì)胞的損傷作用。MTT 檢測(cè)證實(shí)酒精對(duì)SH-SY5Y 細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并且呈濃度依賴(lài)性。另外通過(guò)PI 染色法進(jìn)一步觀察證實(shí)，酒精可誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡。以上結(jié)果提示SH-SY5Y 細(xì)胞對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷敏感，可用于建立研究AAD 發(fā)病機(jī)制的體外模型。

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