鈣敏感受體在癲癇大鼠發作中的表達和凋亡通路的變化

郭 津，李曉捷，姜志梅，張麗華，龐 偉，呂智海，王魯川，張明達

鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)屬G 蛋白偶聯受體C 家族成員，具有氨基胞外域(ECD)、7 個跨膜結構組成的中心區(TMD s)和胞內羧基末端(COOH)［1，2］。1993 年，CaSR 首先發現于牛甲狀旁腺，CaSR 不僅在維持機體Ca2+和其它金屬離子穩態發揮關鍵作用，而且參與調節細胞分化、增殖、凋亡、基因表達、離子通道開放等［3～6］。本實驗觀察戊四氮誘導的大鼠癲癇發作模型中的CaSR 表達規律，及氧化應激和細胞凋亡在癲癇發作中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 戊四氮(pentetrazole PTZ 美國sigma 公司);髓過氧化物酶(MPO)試劑盒和黃嘌呤氧化酶(XOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所);TUNEL 檢測試劑盒(羅氏公司)Beckman DU640 紫外分光光度計H-600 型;紫外凝膠檢測和成像系統(Bio-Rad)。

1.2 大鼠癲癇發作模型的復制 Wistar 大鼠，雌雄各半，體重200±20g，由佳木斯大學動物實驗中心提供。采用大鼠腹腔注射PTZ［35mg/(kg·d)］，連續28d，制備大鼠癲癇模型。

1.3 實驗分組 動物隨機分為2 組(每組n=12):對照組(control group)，癲癇組(epilepsy group)。

1.4 觀察指標

1.4.1 XOD、MPO 的含量測定 大鼠麻醉后，眼球取血2ml，待血液凝固后，3000r/min 4℃離心10min，取上層血清，嚴格按試劑盒說明操作，分別測定XOD、MPO 的含量。

1.4.2 海馬組織尼氏染色的光鏡觀察 實驗結束后，從大鼠海馬部切取的1mm×1mm×1mm 腦組織，用4%多聚甲醛磷酸緩沖溶液固定24～48h。常規脫水、浸蠟、包埋、染色、透明和封片，制成尼氏普通的染色切片，進行光學顯微鏡觀察。

1.4.3 CaSR、Bax、Bcl-2 和caspase-3 蛋白表達的檢測 海馬組織放入研缽中，低溫研磨后，加入蛋白裂解液及苯甲基磺酰氟(Phenyl methane sulfonyl fluoride PMSF)，冰上放置40min，4℃下12000r/min離心40min，取上清。以BSA 為標準，用Bradford 法對上清進行蛋白定量。取20μg 蛋白樣品，10%SDS-PAGE 電泳，100V 轉移1h 至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37℃封閉1h;抗分別為anti-CaSR(1∶3000)、anti-Bax(1∶500)、anti-Bcl-2(1∶500)、anti-caspase-3(1∶500)，4℃過夜。同時，另1 張用不含抗體TBS-T 液孵育，作為陰性對照。反復洗膜后，將膜與堿性磷酸酶(AP)標記的抗IgG 抗體(1∶1000)孵育，室溫輕搖1h，洗膜后，用Western blotting印跡觀察，用圖像分析測定各帶吸光度(A)值做定量分析。

1.4.4 TUNEL 染色 切片常規脫蠟脫水，20μl 蛋白酶K 室溫孵育15～30min，消化組織蛋白3% H2O2溶液浸泡10min，滅活內源性酶，滴加50μl TUNEL 反應混合液，37℃孵育60min，50μl POD 標記的抗熒光素抗體滴于玻片，37℃孵育30min，DAB顯色20min 蘇木素復染，PBS 沖洗，脫水、透明、封片。光鏡下正常海馬神經元核染成藍色(TUNEL 陰性)，凋亡細胞核呈棕褐色(TUNEL 陽性)。每張切片隨機取5 個以上高倍視野，計數不少于500 個海馬神經元，計算凋亡率。公式如下:凋亡率=(凋亡細胞數/500)×100%。

2 結果

2.1 XOD 和MPO 的含量變化 實驗結束時測定大鼠XOD 和MPO 的含量，檢測結果癲癇組明顯高于正常組(P＜0.01 vs contro l)(見表1)。

表1 XOD 和MPO 的含量變化

2.2 海馬組織的形態學變化 對照組皮質區神經細胞排列整齊，邊緣清晰，胞漿淡染，胞漿內尼氏小體豐富。癲癇組細胞形態不完整，細胞腫脹、破裂、輪廓模糊、排列紊亂、細胞間距加大，胞漿內尼氏小體減少。對照組神經元數目為102.56±11.37，癲癇組神經元數目為36.62±4.09，對照組與癲癇組相比差異有統計學意義(P＜0.01)(見圖1)。

圖1 光鏡下海馬組織尼氏染色的觀察(×40 倍)

2.3 大鼠海馬組織CaSR 蛋白表達情況 大鼠CaSR 的蛋白表達，癲癇組明顯高于正常組(P＜0.05 vs control)(見圖2)。

2.4 大鼠海馬組織Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達情況 大鼠Bax 的蛋白表達，癲癇組明顯高于正常組(P＜0.05)(見圖3)。大鼠Bcl-2 的蛋白表達，癲癇組明顯低于正常組(P＜0.05)(見圖4)。大鼠caspase-3 的蛋白表達，癲癇組明顯高于正常組(P＜0.05)(見圖5)。

圖2 不同組別海馬組織中CaSR 蛋白的表達(* P＜0.05 vs control)

圖3 不同組別海馬組織中Bax 蛋白的表達(* P＜0.05 vs control)

圖4 不同組別海馬組織中Bcl-2 蛋白的表達(* P＜0.05 vs control)

圖5 不同組別海馬組織中caspase3 蛋白的表達(* P＜0.05 vs control)

2.5 大鼠海馬組織細胞凋亡變化 在大鼠神經細胞TUNEL 染色中，細胞核呈棕色為凋亡陽性細胞，細胞核呈藍色則為非凋亡的陰性細胞。結果表明:與對照組相比，癲癇組凋亡細胞數明顯增多(見圖6)。

圖6 大鼠海馬組織TUNEL 染色結果(* P＜0.05 vs control)

3 討論

癲癇是一種常見的以反復突然發作的意識喪失伴抽搐為主要癥狀的慢性神經系統疾病，全世界有超過五千萬的癲癇患者［7，8］。但由于對癲癇認識的局限性，癲癇的病因和發病機制尚不完全清楚［9～11］。點燃模型為目前應用最廣泛的癲癇模型，特別是其發病機制被認為與人類癲癇的發病機制相似。PTZ 點燃不僅可進行性提高發作易感性，還可引起腦功能改變，現被公認為難治性癲癇的理想模型。鑒此，本實驗采用連續腹腔注射PTZ 的方法復制癲癇模型。結果顯示:模型組有連續多次的Ⅲ～Ⅴ級癲癇發作，根據文獻報道的標準可以認為實驗動物均達到點燃標準，癲癇模型制備成功。

采用Western blotting 技術，本文觀察到模型組腦組織CaSR 蛋白表達明顯增多，它提示腦組織CaSR 的表達增加參與了癲癇的發生。我們在癲癇的海馬神經元模型中，運用CaSR 激動劑和阻斷劑，進一步證實CaSR 的表達增加通過激活凋亡信號通路促進海馬神經元凋亡的發生(另文發表)。本文還觀察到模型組血清中XOD 和MPO 含量升高，這表明氧化應激是癲癇所致腦損傷的內在機制之一。我們前期研究已證明，細胞外鈣增加及其它CaSR激動劑(Gd3+、精胺等)可通過G 蛋白PLC-IP3 信號轉導途徑，引起肌漿網內鈣釋放增加，導致細胞內游離鈣增多，發生細胞內鈣超載。

眾多實驗表明，Bcl-2 家族促凋亡成員(如Bax、Bak 和tB id 等)在凋亡因素刺激下可轉位到線粒體外膜形成孔道，而抑凋亡成員(如Bcl-2、Bcl-xl)則可阻止之。因此，抑凋亡與促凋亡成員之間的平衡將決定細胞生存或凋亡。一般認為，過度的Ca2+內流在癲癇的發生上起著重要的作用，尤其是引起細胞凋亡和壞死。在我們的實驗中，HE 染色、TUNEL 染色觀察均證明，PTZ 所致大鼠癲癇模型發生了明顯的海馬神經元凋亡或壞死。本實驗還觀察到:模型組caspase-3 活化后形成的17×103的多肽片段及Bax 的表達明顯高于對照組，Bcl-2 的表達明顯低于對照組。可見，模型組細胞凋亡的發生，顯然與抑凋亡成員與促凋亡成員之間的失衡有關［12］。

綜上，PTZ 復制癲癇發作模型可引起大鼠腦組織CaSR 表達增加和細胞凋亡，其機制與氧化應激和細胞凋亡可能也參與了癲癇的發作。

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