同型半胱氨酸對BMVECs 凋亡相關基因BCL-2/BAX 表達的影響

孫文萍，謝春香，趙節緒

高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)引起動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的機制還不完全清楚，但是研究發現，同型半胱氨酸可以破壞血管內皮細胞，促進其凋亡，造成內皮功能障礙［1，2］，這是其中一項重要的機制。本實驗通過培養大鼠的腦微血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cells，BMVECs)，研究同型半胱氨酸促使BMVECs 產生凋亡的可能途徑。

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI-1640 培養基、優質胎牛血清(Gibco，美國);膠原酶Ⅱ型(sigma，美國)、促內皮細胞生長因子(Roche，美國)、D，L-homocysteine(Hcy)(Sigama美國)、生物素化山羊抗兔IgG(北京中山試劑公司)、兔抗NF-κB p65 多克隆抗體(Santa Cruz，美國)，總RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自Sigama，逆轉錄-聚合酶鏈反應試劑盒、引物購自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 BMVECs 細胞培養及鑒定

本實驗室已經培養成功并通過Ⅷ因子抗原免疫染色鑒定的大鼠BMVECs，取第三代細胞用于實驗。

1.2.2 MTT 實驗

按1×103～1×104/ml 密度接種細胞于96 孔培養板中，分成兩大組，待細胞貼壁后一組加不同濃度藥物(Hcy 50μmol/L、Hcy 200μmol/L、Hcy 1000μmol/L、Hcy 2000μmol/L)和CuSO4(4μmol/L)共同培養18h;另一組只加不同濃度的Hcy 進行培養，每種濃度平行8 孔;另設對照組。干預18h 后每孔加入MTT 溶液20ml，37℃，繼續孵育4h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，然后每孔加入150ml DMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解;選擇570nm波長，以空白培養液調零點，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值A，記錄結果。實驗重復3 次，繪制時間、劑量效應曲線。

1.2.3 細胞免疫化學法(ABC 法)檢測NF-κB p65 的表達

細胞爬片后固定、封閉，分別加入一抗和二抗后顯色，于Luzex-F 圖像分析儀(加拿大)下計數每張片子5 個視野的NF-κB p65 陽性細胞率。

1.2.4 蛋白質免疫印記分析(Western-bolt 法)NF-κB p65 的表達

取1×107細胞提取胞核蛋白，電轉膜法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的PBS液浸泡硝酸纖維膜，以封閉非特異抗體結合。加入一抗兔抗NF-κB p65 多克隆抗體(1∶1000)，常溫下搖振4h，加二抗HRP 羊抗兔IgG(1∶5000)常溫下搖振2h。ECL 檢測試劑盒顯影，X 線壓片曝光，HPIAS-1000 型圖像分析系統分析結果。

1.2.5 RT-PCR 法檢測Bax 及Bcl-2 的表達

BMVECs 分為4 組，分別加入1mmol/L 的Hcy及4μmol/L CuSO4，各培養0、6、12 和18h 后，分別收集細胞，提取總RNA，以2μg 總RNA 進行反轉錄。擴增Bcl-2(正義引物:5 ’-CACCC2CTGGCATCTTCT-CCTT-3’，反義引物:5’-CACAATCCTCCCCCAGTTCACC-3’，)，擴增產物長度為304bp;Bax(正義引物:5’-ATGGCTGGGGAGACACCTGAG-3 ’，反義引物:5 ’-CTAGCAAAGTAGAAGAGGGCAAC-3’);，擴增產物長度為240 bp;內參照β-actin(正義引物:5’-TTGTAACCAACTGGGACGATATGG-3’，反義引物:5 ’-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3’)，擴增產物長度為764 bp。擴增條件:94 ℃變性1min，55 ℃退火1min，72 ℃延伸2min，循環35 次。擴增完畢后取PCR 產物10μl 于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測，凝膠圖像分析儀(法國VL 公司，Bio-ID)分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 MTT 結果

細胞培養18h 后，我們發現，單獨添加Cu-SO(4μmol/L)組的細胞存活率沒有受到影響;培養液中不含CuSO4(4μmol/L)時，各Hcy 濃度組細胞OD570 值無顯著區別(P＞0.05);當培養液中添加CuSO4(4μmol/L)時，Hcy 濃度為1mmol/L 及2 mmol/L 的兩組細胞OD570 值明顯降低(P 分別為0.034 和0.006)，而 Hcy 濃度為50μmol/L、200μmol/L 的兩組細胞OD570 值較對照組差異不顯著(P＞0.05))。因此以后的試驗中，我們選用的Hcy 干預濃度為1 mmol/L(含CuSO44μmol/L)。

2.2 NF-κB p65 表達的免疫細胞化學檢測

正常情況下，即血管內皮細胞未受到外界刺激時，由于NF-κB 和IκB-α 蛋白質結合成三聚體形式存在于細胞質，NF-κB 處于未活化狀態。故1mmol/L 的Hcy+4 μmol/L CuSO4干預細胞后，0h 組細胞染色后NF-κB p65 只在細胞漿表達，胞漿染色淡;6h后，NF-κB 不僅在細胞漿內表達增強，而且轉入細胞核內表達，發生核轉移，謂之陽性細胞(P＜0.05)，在12h 時達高峰，細胞核著色明顯，陽性細胞百分數顯著增多(P＜0.01);而到18h 時，NF-κB 核轉位的現象開始減弱(P＞0.05)。

2.3 NF-κB 表達的Western-blot 法檢測

Western 印跡雜交結果與免疫細胞化學結果基本一致。在對照組細胞的核蛋白提取液中，基本沒有NF-κB 的表達;1.0mmol/L Hcy+4 μmol/L Cu-SO4刺激細胞6h 出現核蛋白提取液中NF-κB 的表達，12h 時達高峰，到18h 時表達減少。

2.4 Bax 及Bcl-2 mRNA 的表達

Hcy 作用后0～18h，細胞Bcl-2 mRNA 水平逐步降低，而Bax mRNA 水平逐步升高。二者的比值呈下降趨勢(見圖1～圖4)。

圖1 不同時間點Bcl-2 與β-actin 的mRNA 比值

圖3 不同時間點Bax 與β-actin 的mRNA 比值

圖4 不同時間點Bax 的mRNA 表達

3 討論

細胞凋亡是一個極其復雜、精密的過程，涉及到許多事件的發生，包括凋亡相關基因表達的升高或下調等。已證實，細胞凋亡的發生主要通過兩條途徑產生:即線粒體凋亡途徑和死亡受體(Fas-FasL)介導的途徑［3］。在病理條件下，Hcy 攻擊的主要靶細胞是血管內皮細胞，它可以造成血管內皮細胞凋亡，是發生動脈硬化的始動部位。有研究認為，Hcy可以通過多方面的作用引起內皮細胞凋亡。Austin認為Hcy 誘導的內皮細胞凋亡主要有兩個途徑［4］:其一為未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)介導的細胞凋亡;此外，胱冬酶-3(caspase-3)的激活是Hcy 引起細胞凋亡的另一機制。Hcy 能造成細胞內ROS 增加，使線粒體失去正常的跨膜電位，導致細胞色素C(cytochrome-c)的釋放，進而激活caspase9、6、3，最后出現核蛋白降解，DNA 斷裂，細胞死亡［5］。Kerkeni 發現，Hcy 的衍生物同型半胱氨酸硫內酯(homocysteine thiolactone)，通過激活caspase-3 使人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)細胞DNA 斷裂，細胞死亡［6］。在這一病理過程中，caspase-3 和線粒體細胞色素C 的活性和釋放均明顯增加［7］。在caspase-3 和線粒體細胞色素C 介導的線粒體凋亡途徑中，線粒體膜通透性轉變孔(permeablity transition pore，PTP)的開放和關閉是決定細胞是否發生凋亡的關鍵［8］。而Bcl-2 家族成員對細胞凋亡的調控主要是通過調控線粒體的PTP 的開放和關閉來實現的。其中Bcl-2 和Bax 是一對正負凋亡調節基因，Bcl-2可抑制PTP 的開放從而抑制凋亡因子的釋放和阻止凋亡的發生，而Bax，Bad，Bak 等作用恰恰相反，它們促進PTP 開放，從而促進凋亡因子釋放。細胞中的Bax 蛋白可自身形成同源二聚體，并易與Bcl-2蛋白形成異源二聚體復合物，從而使Bax 失活。Bcl-2 表達相對增多時，Bcl-2/Bax 二聚體增多，消除Bax 的促凋亡效應，而Bax 表達相對增多時Bax/Bax同源二聚體增加，促凋亡作用上調。Duan［9］用不同濃度的Hcy 干預HUVEC 24h，發現Hcy 可以上調Bax 的表達，下調Bcl-2 的表達;Tyagi［5］培養鼠心微血管內皮細胞，通過cDNA 芯片檢測發現，Hcy 使mRNA 水平的Bcl-2/Bax 比值下降，激活caspase9、3，進而引起細胞凋亡。

我們的研究發現，Hcy 對BMVECs 的生長有明顯的抑制作用，可以造成細胞死亡。并且干預組BMVECs 的Bcl-2 mRNA 于處理后0～18h 呈持續降低趨勢，而Bax mRNA 基本呈增高趨勢，Bcl-2/Bax比值降低。此結果提示，Hcy 可能通過抑制Bcl-2 基因表達，促進Bax 基因表達，使Bcl-2/Bax 比值降低，致使細胞凋亡和存活信息平衡失調，從而最終誘導細胞調亡。可見Bcl-2 和Bax 基因在Hcy 誘導BMVECs 細胞凋亡過程中同樣起著重要的作用。

Bcl-2 和Bax 基因的表達受核轉錄因子NF-κB及JNK 等途徑的調控。有人［4，10，11］在觀察Hcy 對平滑肌細胞及內皮細胞的影響時發現，Hcy 可以激活NF-κB，促進NF-κB 的核轉位。用超氧負離子清除劑或I-κB 抑制劑可抑制Hcy 誘導的IKK 激活和NF-κB 激活［12］。我們在蛋白質水平上檢測到，Hcy干預后不同時間點腦微血管內皮細胞的NF-κB 的的表達，結果證實有NF-κB 核轉位的變化:6h，NFκB 已經出現胞核內表達;12h 時達高峰，細胞核著色明顯;18h 時，這一現象開始減弱。已知NF-κB 是能調節多種炎癥和免疫基因表達的一種重要的轉錄調控因子，它在相當廣泛的病理生理過程中起調控作用，其中包括細胞凋亡現象。現有的部分實驗研究表明，NF-κB 激活能保護細胞免于凋亡，而另一些研究中則發現，NF-κB 能促進凋亡基因的表達。可見NF-κB 的激活在細胞凋亡中的調控作用是多層次多方面的，這可能與研究細胞的種類及所處應激環境不同有關。本研究中觀察到，隨著NF-κB 的激活，Bcl-2 mRNA 于處理后0-18 h 呈持續降低趨勢，而Bax mRNA 轉錄水平呈增高趨勢，提示在Hcy 致內皮細胞損傷的過程中，NF-κB 有可能參與了Bc1-2 和Bax 基因介導的細胞凋亡途徑。

［1］Alkhoury K，Parkin SM，Homer-Vanniasinkam S，et al.Chronic homocysteine exposure upregulates endothelial adhesion molecules andmediates leukocyte:endothelial cell interactions under flow conditions［J］.Eur J Vasc Endovasc Surg，2011，41(3):429－435.

［2］Dionisio N，Jardín I，Salido GM，et al.Homocysteine，intracellular signaling and thrombotic disorders［J］.Curr Med Chem，2010，17(27):3109－3119.

［3］Zakeri Z，Lockshin RA.Cell death:history and future［J］.Adv Exp Med Biol，2008，615:1－11.

［4］Austin RC，Lentz SR，Werstuck GH.Role of hyperhomocysteinemia in endothelial dysfunction and atherothrombotic disease［J］.Cell Death and Differentiation，2004，11:56－64

［5］Tyagi N，Ovechkin AV，Lominadze D，et al.Mitochondrial mechanism of microvascular endothelial cells apoptosis in hyperhomocysteinemia［J］.J Cell Biochem，2006，98(5):1150－1162.

［6］Kerkeni M，Tnani M，Chuniaud L，et al.Comparative study on in vitro effects of homocysteine thiolactone and homocysteine on HUVEC cells:evidence for a stronger proapoptotic and proinflammative homocysteine thiolactone［J］.Mol Cell Biochem，2006，291(1－2):119－126.

［7］Li L，Hu BC，Gong SJ，et al.Homocysteine-induced caspase-3 activation by endoplasmic reticulum stress in endothelial progenitor cells from patients with coronary heart disease and healthy donors［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2011，75(7):1300－1305.

［8］Rasola A，Bernardi P.Mitochondrial permeability transition in Ca2+-depen-dent apoptosis and necrosis［J］.Cell Calcium，2011，50(3):222－233.

［9］Duan J，Dai S，Fang CX，et al.Phytoestrogen alpha-zearalanol antagonizes umbilical vein homocysteine-induced imbalance of nitric oxide/endothelin-1 and apoptosis in human endothelial cells［J］.Cell Biochem Biophys，2006，45(2):137－145.

［10］Au-Yeung KK，Woo CW，Sung FL，et al.Hyperhomocysteinemia Activates Nuclear Factor-kB in Endothelial Cells via Oxidative Stress［J］.Circ Res，2004，94:28－36.

［11］Lin CP，Chen YH，Chen JW，et al.Cholestin(Monascus purpureus rice)inhibits homocysteine-induced reactive oxygen species generation，nuclear factor-kappaB activation，and vascular cell adhesion molecule-1 expression in human aortic endothelial cells［J］.J Biomed Sci，2008，15(2):183－196.

［12］Au-Yeung KKW，Woo CWH，Sung FL，et al.Hyperhomocysteinemia Activates Nuclear Factor-κB in Endothelial Cells via Oxidative Stress［J］.Circ Res，2004，94:28－36