牛奶中殘留抗生素的快速檢測方法研究

劉雪瑩

山東省菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校

1 概述

抗菌藥物被廣泛應(yīng)用于治療養(yǎng)殖動物，有時也被作為生長促進劑使用[1]。這些藥物的大量利用必然導(dǎo)致食品中留有殘留物。抗菌藥物殘留物的存在引起了人們對消費者健康的關(guān)注。主要考慮對象為：（i）對接觸過的個體可能產(chǎn)生的過敏性敏化作用；（ii）抗菌藥物殘留物甚至在濃度低于最高殘留限量時也有可能對人體腸道施加選擇性壓力；（iii）選擇抗藥性細(xì)菌的可能性。

根據(jù)高性能的非侵入性二氧化碳傳感器的具體應(yīng)用情況，人們研發(fā)了電化學(xué)傳感器系統(tǒng)，以可靠、快速、低成本的研究微生物學(xué)過程。在本研究中，作者將二氧化碳傳感器用于檢測和鑒定牛奶中殘留的喹諾酮和四環(huán)素。這種測量以生成二氧化碳的速率為基礎(chǔ)，其中二氧化碳生成的速率與敏感菌生長的抑制有關(guān)。本文針對喹諾酮和四環(huán)素開展了實驗研究，因為人們認(rèn)為應(yīng)特別關(guān)注牲畜生產(chǎn)中最后使用的這些物質(zhì)，而且這些物質(zhì)能夠治療通過食物鏈把動物源性細(xì)菌傳播至人體而導(dǎo)致的各種人體感染（包括胃腸道感染）。對喹諾酮和四環(huán)素的耐藥性會限制許多感染的藥物選擇。此外，對這兩種藥物具有耐藥性的生物體通常也會對其它類別的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。這種情況下，首先必須鑒定在養(yǎng)殖動物中喹諾酮和四環(huán)素的使用給公共衛(wèi)生造成的風(fēng)險，這有助于研發(fā)適合于有效食品管理的分析方法。

2.實驗

2.1 材料和試劑

2.1.1 氣體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GRMs）

在傳感器標(biāo)定中使用了濃度分別為348、1253、1745、2881和6600ppm的CO2（產(chǎn)自意大利羅馬的SIADSrl）。

2.1.2.微生物

本研究所用的微生物為大腸桿菌ATCC11303。也測試了其它微生物，但是因為大腸桿菌對喹諾酮和四環(huán)素比較敏感、繁殖時間短、更重要的是，大腸桿菌不會致病，所以選定了大腸桿菌。把細(xì)胞存儲于4℃環(huán)境下的Mueller-Hinton瓊脂斜面上，并在37℃環(huán)境下的Mueller-Hinton肉湯中生長。利用紫外分光光度計（確定培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)為1×107mL-1。

2.1.3.標(biāo)準(zhǔn)

Sigma提供了四環(huán)素（TC）、土霉素（OTC）、氯四環(huán)素（CTC）、萘啶酸（NALA）、恩諾沙星（ENRO）、麻保沙星（MAR）、諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIPRO）、氟甲喹（FLU）和單諾沙星（DAN）等標(biāo)準(zhǔn)品。制備了各喹諾酮和四環(huán)素在水中的標(biāo)準(zhǔn)貯備液（10mg/L），并把它們存放于-18℃的環(huán)境中。用適量的水稀釋了各標(biāo)準(zhǔn)貯備液，從而制備了所有藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.樣品制備

就各個被測驗的抗生素而言，都用了純牛奶樣本（X0）作為對照組，分析了三種添加25（X1）、50（X2）和100（X3）μg/L喹諾酮和四環(huán)素的牛奶樣品。選擇了濃度為25μg/L的牛奶，因為這一濃度比牛奶的最高殘留限量（即30μg/L的單諾沙星）低。牛奶中喹諾酮和四環(huán)素等其它最高殘留限量都較高，在50至100μg/L范圍之內(nèi)。

制備樣品時，添加了4mL培養(yǎng)基、0.5mL標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)菌培養(yǎng)基（1×107mL-1）作為接種物、以及0.5mL純牛奶；而在制備對照樣品時，添加了0.5mL三種不同濃度的添加藥物的牛奶。

2.3 傳感器分析

2.3.1 總體微生物環(huán)境因素

眾所周知，用時間函數(shù)描繪細(xì)菌增長的實驗曲線是S形曲線；曲線表示了四個不同的階段：即遲緩期（潛生長）、對數(shù)期（指數(shù)生長）、穩(wěn)定期和衰亡期。

命名為對數(shù)期的原因是因為通常用對數(shù)型數(shù)學(xué)模型代表這一階段。事實上，在這一階段，微生物（Mi）的數(shù)量增加，各繁殖時間（tr）內(nèi)微生物數(shù)量翻倍增長；求得時間t時Mi（n）的數(shù)量為：

其中n0表示Mi的起始數(shù)量。n與2(t/tr)之間存在指數(shù)關(guān)系；而logn與t之間存在線性關(guān)系。必須添加正確的條件，同時考慮Mi的衰亡率、基質(zhì)以及微觀環(huán)境因素。

根據(jù)方程（1），假設(shè)各微生物以恒定的速度（G，mol/s）通過呼吸生成CO2，那么求得對數(shù)期CO2的總體生成速率（CO2，mol/s）為：

2.3.2 抑制劑的作用

可以通過如下等式表示存在抑制劑時微生物的有氧呼吸過程：

其中沒有水；Mi表示微生物；M表示培養(yǎng)基；In表示抑制劑；Ca表示降解產(chǎn)物；而O2和CO2表示溶解氧和二氧化碳，取自于氣相。分析測量可能會考慮到所有這些成分（即，Mi、M、In、Ca、O2和CO2）。在本研究中，用于間接測定抑制劑抗菌活性的分析物為CO2。

利用培養(yǎng)基中的載氣分離了微生物生成的二氧化碳，從而求得了與二氧化碳?xì)怏w濃度相關(guān)的emf（E，mV）：

其中，k°和k表示利用氣體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（如已知yco2值的空氣樣品）通過校正步驟求得的實驗值。

圖1.CO2傳感器設(shè)計圖

圖2.電化學(xué)生物傳感器系統(tǒng)簡圖

圖3.所記錄信號E相對時間的曲線

2.3.3.儀器

利用高性能的非侵入性二氧化碳傳感器，結(jié)合使用敏感細(xì)胞等細(xì)菌培養(yǎng)基，研發(fā)了一種新的分析系統(tǒng)。該電化學(xué)儀器是一種原電池，其中包括浸泡于工作電解液（WS）的參比電極（RE），并通過蠶絲（親水性物質(zhì)）與指示電極（IE）相接；這種蠶絲作為傳感器薄膜（SM）使用。指示電極是一種金屬腐蝕電極，而參比電極是傳統(tǒng)型電極或與指示電極類似的腐蝕電極。工作電解液是一種流動性的或靜止溶液；其構(gòu)成成分符合yco2水平要求，并能預(yù)防其它氣體化學(xué)物的阻礙作用。在本研究中，工作電解液就是0.1m水中的KCl、濃度為10-4至10-2m的強堿（如Na2CO3）、以及二氧化碳，直至溶液飽和為止。圖1所示為二氧化碳傳感器。該傳感器的外殼能保護它不受電流和通風(fēng)的影響。在傳感器中鋼管與玻璃行業(yè)特有的電解池相接。利用個人計算機控制的萬用表（產(chǎn)自惠普，型號為Agilent34401A）開展了電位測量。用個人計算機的目的在于獲取和加工數(shù)據(jù)（計算機產(chǎn)自惠普的AgilentIntuiLink）。圖2所示為電化學(xué)生物傳感器系統(tǒng)的簡圖。

表1

2.3.4.分析程序

讓載氣以恒定的速率通過含有5mL培養(yǎng)基的參比電池以及二氧化碳傳感器流動，直至基線值（E°，MV）保持恒定不變?yōu)橹埂Ｈ缓螅ㄟ^樣品電池（Xi）連續(xù)把載氣轉(zhuǎn)移，然后到傳感器中。至180分鐘時求得了電位差ΔE和時間的值。

五分鐘的分析過程如下：

一分鐘分析。

四分鐘用于分析傳感器重新平衡以及通過參比電池（R）的載氣。圖3所示為所記錄的信號。

2.3.5.統(tǒng)計分析

用參數(shù)和非參數(shù)統(tǒng)計分析獲得了各微生物的實驗結(jié)果。此外，為了評估不同濃度抗菌物與純牛奶之間差異的顯著性，開展了多因子變異數(shù)分析。并將Statgraphics軟件用于編程。

3.結(jié)果與討論

對氣體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GRMs）的分析測定結(jié)果表明，濃度在348至6600ppm這一區(qū)間時，傳感器的精確度良好（0.8左右），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（σ，%）大約為2.4%。

表1所示為所有樣本分析的結(jié)果。

總之，研究中的所有喹諾酮和四環(huán)素都具有很強的抗菌活性。結(jié)果充分證明，在120分鐘后抑制程度具有顯著意義。在180分鐘范圍內(nèi)，抑制程度一直呈現(xiàn)上升趨勢。過了這一時間后，ΔE不再發(fā)生顯著變化。

結(jié)語

本研究研發(fā)的實驗方法和分析方法似乎足以達(dá)到本文的目的。例如，與傳統(tǒng)的篩查法，細(xì)菌抑制法和免疫測定法相比，本文研發(fā)的實驗與分析方法具有如下優(yōu)勢：（i）分析所費時間非常短（大約120分鐘）；（ii）樣本量較小（大約為0.5mL）；（iii）不需要處理樣本；（iv）精確度高；以及（v）可能會連續(xù)地跟蹤抑制過程。

此外，把二氧化碳傳感器系統(tǒng)與大腸桿菌ATCC11302培養(yǎng)基結(jié)合使用，特定用于測驗喹諾酮與四環(huán)素；但是其它抗菌藥物沒有產(chǎn)生可測量的分析信號。因此，可以把該方法用于鑒定陽性樣品，而且該方法有助于更好的進行之后的化學(xué)鑒定。

最后，發(fā)現(xiàn)傳感器的靈敏度很好，因為它能檢測濃度小于等于25μg/L時殘留的所有本文研究的喹諾酮類與四環(huán)素類物質(zhì)。從這點來看，當(dāng)前為牛奶確定的最高殘留限量（MRLs）都比25μg/L這一濃度高。

鑒于本研究獲得的良好結(jié)果，之后會利用不同于大腸桿菌的其它試驗微生物研究其它類別的抗菌藥物，以擴展這一方法的應(yīng)用領(lǐng)域。此外，也將考慮其它食品基質(zhì)。這會是替代傳統(tǒng)篩查法的一種有效措施，為此，這是個很好的值得研究的出發(fā)點。通常情況下，把這種簡單、低成本、快速靈敏的方法用于檢測殘留的抗菌物，以加強抗菌藥物領(lǐng)域的食品管理與監(jiān)督。

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