重組大腸桿菌產耐高溫β－糖苷酶發酵條件優化

盧 楠，馮惠勇，王立暉

（1.河北化工醫藥職業技術學院制藥工程系，河北石家莊 050026；2.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018；3.天津現代職業技術學院生物化工系，天津 300222）

糖苷酶是一大類催化糖苷鍵水解的酶，在國際酶學命名方法中歸位序EC 3.2.1，是目前用于酶法合成糖苷和低聚糖的一類重要的酶類。特別是某些種類的酶對乳糖有較高水解活性，在水解乳糖分子中β－1，4－半乳糖苷鍵的同時，具有轉半乳糖基作用，以乳糖或其水解產物半乳糖和葡萄糖為糖基受體合成半乳糖苷鍵，生成低聚半乳糖（galacto－oligosaccharides，GOS）［1－10］。

本研究室構建保藏的基因工程菌株產生的耐高溫β－糖苷酶ttβGLY具有較高的乳糖水解活性和轉糖基活性，它的耐熱性能有利于酶的分離純化，可在高溫體系中反應，具有反應速度快、轉化率高的特點，在應用上有更大優越性。

筆者對本研究室構建保藏的產耐高溫β－糖苷酶重組大腸桿菌的培養基和搖瓶發酵條件進行了探討，為大幅度提高β－糖苷酶發酵產量提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

產酶菌株重組大腸桿菌，為本實驗室構建菌種。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨，酵母粉，生化試劑，北京奧博星生物技術有限公司提供；磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，七水硫酸鎂，乳糖，葡萄糖，蔗糖，甘油，尿素，氯化鈉，皆為分析純，天津市紅巖化學試劑廠提供；氨芐青霉素，北京鼎國生物技術責任有限公司提供；葡萄糖試劑盒，北京北化康泰臨床試劑有限公司提供；乳清，自制；玉米漿，石藥集團維生藥業有限公司提供；其他試劑均為市售分析純或化學純。

1.1.3 主要儀器

HH.BⅡ型電熱恒溫培養箱，天津市實驗儀器廠提供；TGL－16C型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠提供；SW－CY－2FD型潔凈工作臺，上海博迅實業有限公司醫療設備廠提供；Multiskan MK3型酶標儀，上海雷勃分析儀器有限公司提供；HYG－ⅡB型生物反應搖瓶柜，上海欣蕊有限公司提供。

1.1.4 培養基

基礎培養基為LB培養基:酵母粉（5g/L）、蛋白胨（10g/L）、氯化鈉（10g/L），pH值調至7.0，1μL/mL加入100mg/mL的氨芐青霉素。

種子培養基:基礎培養基為LB培養基，葡萄糖、碳酸鈣按實驗優化方案加入，pH值調至7.0，1μL/mL加入100mg/mL的氨芐青霉素。

發酵培養基:氯化鈉（10g/L），碳源、氮源及其他成分按實驗方案加入，pH值調至7.0，1μL/mL加入100mg/mL的氨芐青霉素。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法

種子培養:從斜面種子中取一環菌接種至裝有50mL種子培養基的250mL三角瓶中培養，搖床轉速為200r/min，溫度為37℃，培養12h。

發酵培養:將培養好的種子培養液按照5%的接種量，接種至裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中進行發酵培養，搖床轉速為200r/min，溫度為37℃，培養24h。

每批實驗都安排3組平行對照樣，取實驗結果的平均值進行分析和計算。

1.2.2 菌體量的測定

采用菌體干重法:發酵結束后，取適量菌液離心，棄去上清液，用蒸餾水洗滌后，將濕菌體放入烘干箱，于60℃下烘至恒重后測定菌體干重。

1.2.3 酶活的測定

酶活單位:以乳糖為底物，在溫度70℃、pH值為7.0的條件下，將1min水解產生1mol葡萄糖定義為一個酶活單位（U）。

葡萄糖含量測定:采用葡萄糖氧化酶試劑盒法。

2 結果與討論

2.1 搖瓶培養生長曲線和產酶曲線的測定

以LB為基礎培養基，測定重組大腸桿菌的搖瓶生長曲線和產酶曲線，見圖1。由圖1可以看出:酶活和菌體均在培養時間為21～24h時達到較高，24h后隨著時間延長，產酶量并沒有進一步提高，因此確定24h為適宜的培養時間。由pH值變化曲線可以看出，在發酵過程中pH值從初始的7.0一直上升至8.6。這是由于LB培養基中含有大量氮源，而缺少碳源。碳氮比例的不均衡影響菌體的正常生長和酶活的表達，因此要以LB為基礎培養基，添加不同的碳源及無機鹽進行優化。

圖1 菌體在LB基礎培養基上的生長和產酶曲線Fig.1 Growth curve andβ－glucosidase production curve on LB medium

2.2 種子工藝的優化

2.2.1 葡萄糖加量的確定

初始培養基為LB培養基，鑒于葡萄糖為快速利用的碳源，有利于菌體的生長，此實驗主要考察培養基中葡萄糖質量分數為0～1.0%對菌體生長的影響，并進行工藝優化。培養時間為12h，實驗結果見表1。

表1 種子培養基中葡萄糖濃度對菌體生長的影響Tab.1 Effect of different glucose amount in seed medium on cell growth

由表1結果可知，葡萄糖質量分數為0.4%的菌體干重最高。但當葡萄糖質量分數為0.3%～1.0%時，發酵結束后pH值均低于7.0，而大腸桿菌的生長最適宜pH值為7.0，所以此時菌體生長受到抑制。

2.2.2 碳酸鈣加量的確定

碳酸鈣對發酵過程中的pH值具有緩沖作用。為了減少種子培養過程中pH值大幅度變化對菌體生長的不利影響，本實驗考察了葡萄糖質量分數為0.4%時，添加碳酸鈣對pH值和菌體生長情況的影響。結果見表2。

表2 種子培養基中碳酸鈣加量對菌體生長的影響Tab.2 Effect of different CaCO3amount in seed medium on cell growth

由表2結果可知，加入0.5%（質量分數，下同）的碳酸鈣后發酵液pH值變化幅度減小，更接近大腸桿菌生長的最適宜pH值。從菌體干重可看出，加入0.5%碳酸鈣的菌體生長量更高。

2.2.3 種齡的確定

種齡在發酵過程中是一個重要影響因素。種齡短，種子啟動慢，發酵時間延長；種齡長，菌種老化，代謝能力減弱。種齡一般選擇在菌體生長的對數生長期的末期，本實驗采用優化后的種子培養基，通過對種子生長曲線的測定，確定種子培養時間。結果見圖2。

由圖2可知，菌體干重在0～12h上升較快，之后變化較平緩，因此在優化后種子培養基條件下，選擇12h為適宜的種子培養時間。

2.3 發酵培養基優化

2.3.1 碳源的選擇

LB基礎培養基主要成分為酵母浸粉、蛋白胨，含有豐富的氮源，但由于缺少適宜的碳源，因而在發酵過程中pH值持續上升，影響菌體的正常生長和酶活的表達。碳源物質不僅能促進重組菌的生長，而且對外源基因的表達有密切的影響。以LB培養基作為基礎培養基，添加常用的5種碳源進行實驗，其中乳清添加量以實際含乳糖的量折合計算。結果見表3。

圖2 菌體在優化后種子培養基上的生長曲線Fig.2 Growth curve on optimization of seed medium

表3 碳源對菌體生長及產酶的影響Tab.3 Effect of different carbon substrates on cell growth andβ－glucosidase production

由表3可知:以葡萄糖、蔗糖、甘油為碳源，干重、酶活比基礎培養基均略有增長，但是pH值較低，pH值下降過快不利于酶活的表達和活性的保持；以乳糖、乳清為碳源，對菌體生長和酶活表達均有促進作用，干重和酶活增長較大，pH值變化較小，接近中性；乳糖、乳清添加量從1%增加到2%，菌體干重并沒有明顯變化，酶活反而降低。因此，綜合考慮經濟因素和產酶情況，選擇乳糖和乳清以1%添加量作為碳源進一步優化。

2.3.2 氮源的選擇

以6種氮源分別代替初始產酶培養基中的酵母粉和蛋白胨進行氮源單因素實驗（分別以1%的乳糖和乳清為碳源），氮源添加量以氮源物質的量相等為依據。結果見表4。

表4 氮源對菌體生長及產酶的影響Tab.4 Effect of different nitrogen substrates on cell growth andβ－glucosidase production

由表4可知:以乳糖和乳清為碳源的實驗中，采用無機氮源時菌體量和酶活均低于以蛋白胨、酵母粉作氮源的結果；玉米漿為氮源時，酶活較高，但玉米漿中含有大量渣子、色素類物質，測得干重為16.44g/L，無法準確得出菌體的真正干重，且玉米漿作氮源發酵所制酶液由于含有色素類物質而導致固定化酶活較低。綜合考慮，選用蛋白胨和酵母粉作為氮源。

分別以1%（質量分數，下同）的乳糖和乳清為碳源，以蛋白胨和酵母粉為氮源，改變蛋白胨和酵母粉的量，以確定合適的添加量。結果見表5。

由表5可知，以1%乳糖作為碳源，蛋白胨、酵母粉用量逐級增加，菌體干重隨之增長，但增至蛋白胨1.2%、酵母粉0.6%后繼續增加氮源酶活基本不變。以乳清作為碳源，蛋白胨、酵母粉用量逐級增加，菌體干重隨之增長，蛋白胨1.4%、酵母粉0.7%后繼續增加氮源酶活基本不變。考慮綜合因素，分別選擇碳源為1%乳糖，氮源為蛋白胨1.2%、酵母粉0.6%，記為L1培養基；碳源為1%乳清，氮源為蛋白胨1.4%、酵母粉0.7%，記為L2培養基。

2.3.3 無機鹽配方優化

微生物要維持正常的生長代謝，除需要碳源和氮源外還需要Ca2＋，Mg2＋，K＋等營養元素，這些元素將參與細胞的基礎代謝，因此在配制培養基時必須以無機鹽的形式加入各種必需離子。加入濃度過低，菌體生長緩慢；加入濃度過高，反而會抑制菌體生長，因此必須通過實驗得出其合適的濃度范圍。

表5 氮源添加量對菌體生長及產酶的影響Tab.5 Effect of different nitrogen substrates amount on cell growth andβ－glucosidase production

常用無機鹽有MgSO4·7H2O，MnSO4，KH2PO4，K2HPO4，KCl等。在L1和L2培養基中，分別添加KH2PO4和K2HPO4，考察磷水平對菌體生長和產酶的影響。結果見表6。

表6 磷添加量對菌體生長及產酶的影響Tab.6 Effect of different P amount on cell growth andβ－glucosidase production

由表6可知，L1和L2培養基添加磷鹽量配比為KH2PO40.30%，K2HPO40.50%時有利于菌體的生長和產酶，把此配方培養基分別記為L3和L4培養基繼續進行優化。

在L3和L4培養基中添加MgSO4·7H2O，考察Mg2＋水平對菌體生長和產酶的影響。結果見表7。

表7 Mg2＋添加量對菌體生長及產酶的影響Tab.7 Effect of different Mg2＋amount on cell growth andβ－glucosidase production

由表7可知，L3和L4培養基添加MgSO4· 7H2O為0.10%（質量分數）時有利于菌體的生長和產酶，把此配方培養基分別記為L5和L6培養基。

2.4 發酵條件的優化

發酵條件是影響重組菌生長與產酶的重要因素，以上述優化結果配制發酵培養基，對菌體產酶條件的影響因素進行考察，結果見表8。

表8 接種量對菌體生長及產酶的影響Tab.8 Effect of different inoculum volume on cell growth andβ－glucosidase production

接種量的大小會直接影響發酵周期。接種量過小，發酵周期延長，增加成本；接種量過大，培養基內營養成分消耗快，不利于菌體生長和產酶。由表8可知，接種量為8%時，L5和L6培養基發酵的菌體干重和酶活均達到最高值，故選擇8%為最適宜接種量。

在控制通氣條件時必須考慮到既要滿足菌體生長與胞內酶合成的不同需求，又要考慮節省能源，提高經濟效益。在搖瓶培養條件下，可以通過改變搖床轉速或者裝液量來調節通氣量。本研究固定的搖床轉速為200r/min，通過改變三角瓶裝液量來進行調解氧氣的供應量，保持其他培養條件相同，在250 mL三角瓶中進行24h發酵，結果見表9。

表9 搖瓶裝量對菌體生長及產酶的影響Tab.9 Effect of different amount of shaking flask on cell growth andβ－glucosidase production

由表9可以看出，當溶氧水平為250mL三角瓶中裝液體培養基為40mL時，酶活最高。

3 結 論

對重組大腸桿菌發酵培養基進行了優化，確定出適合工程菌生長和耐高溫β－糖苷酶表達的培養基配方:蛋白胨12g/L，酵母粉6g/L，乳糖10g/L，NaCl 10g/L，KH2PO43g/L，K2HPO45g/L，MgSO4·7H2O 1g/L。或采用乳清為碳源，培養基組成為蛋白胨14g/L，酵母粉7g/L，乳清13.3g/L，NaCl 10g/L，KH2PO43g/L，K2HPO45g/L，MgSO4·7H2O 1g/L。種子培養基組成為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖4g/L，NaCl 10g/L，CaCO35g/L，種齡12h，接種量為8%，裝量40mL/250mL三角瓶，于37℃發酵24h。優化后以乳糖為碳源，菌體干重、酶活最高可達6.830g/L和2.016U/mL，分別是優化前的3倍和2倍；以乳清為碳源，菌體干重、酶活最高可達10.010g/L和2.384U/mL，分別是優化前的4.4倍和2.4倍。

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