止癢藥物的主要藥效學研究方法和觀察指標

劉 曼，孫亭方，王貴林 （長江大學醫學院，湖北荊州434023）

止癢藥物的主要藥效學研究是對藥物的止癢作用進行實驗性評價，目前最常用的評價方法是在瘙癢動物模型上觀察單位時間內的瘙癢次數及瘙癢潛伏時間等行為學表現。但瘙癢行為屬主觀指標，其單獨應用難以客觀評價藥物的止癢效果，常輔以其它指標進行綜合評價。現對止癢藥物的藥效學研究概況作一綜述。

1 瘙癢動物模型的建立

該模型的建立旨在探討瘙癢的病理生理機制和研發止癢藥物，目前瘙癢動物模型主要有3類［1］：①特定種系的自發瘙癢動物模型。Matsuda等發現NC／Nga種系小鼠皮損與人類特應性皮炎相一致，它可以作為理想的皮炎動物模型用于相關藥物研究；MRL／lpr種系小鼠因具有嚴重的自身免疫性疾病而自發表現出瘙抓行為，它可以作為模擬人類某些自身免疫性疾病伴發瘙癢癥狀的理想動物模型。②轉基因動物瘙癢模型。該模型在研究瘙癢的發生機制方面應用廣泛。③致敏物質誘導的瘙癢動物模型。該模型采用單一炎癥介質 （組胺、5－羥色胺、P物質等）或將其配伍組合，通過皮內或皮下注射引發動物的瘙抓動作，觀察并記錄單位時間的瘙抓次數；也可通過多種途徑方式給予化學物質 （如化合物48／80、4－氨基吡啶、右旋糖苷40、二硝基氟苯等）進行致敏，從而引發動物的瘙抓動作。后者在誘發瘙癢的機制和作用效果上優于直接使用外源性炎癥介質，且更接近臨床，常用于止癢藥物的研究。

2 主要觀測指標

2.1 單位時間內瘙癢次數

早在1995年日本富山醫藥大學kuraishi博士研究組就已經制備出小鼠的瘙癢動物模型［2］，該模型采用皮下、皮內或灌胃給藥等方式將致癢物質注入實驗動物體內，然后觀察記錄各實驗小組小鼠在建模后一段時間的瘙抓行為。Oliveira等［3］分別采用化合物48／80和低分子右旋糖苷40作為致癢劑造模，在頸背側部位注射化合物48／80，以前、后爪撓鼻子和后爪撓注射部位為瘙癢標準，而注射低分子右旋糖苷40則以除了舔舐動作外瘙抓全身作為一次瘙癢記錄。瘙癢次數因選擇的致癢劑不同或觀測者的主觀差異性使得瘙癢的標準難于統一。Jiang等［4］學者在每只實驗小鼠后腿皮下植入小磁石，然后放入1個四周環繞著圓形線圈的觀察室里觀察，利用小鼠瘙抓時后腿動作產生感應電流的原理采用特殊儀器記錄，使觀測過程更簡單、結果更準確，但是對小鼠本身會造成一定傷害。新近發現的SCLABA－Real系統分析方法是一種比較客觀簡易的無創性記錄分析方法，放置在觀察籠頂部的高速數字圖像采集系統可以同時對4只小鼠的行為進行實時記錄分析。實驗結束后對藥物組、模型組、對照組的瘙癢次數進行統計學處理，可采用單因素方差分析法［3］，此法可以消除多組間比較時的抽樣誤差。

2.2 瘙抓反應潛伏時間和單次瘙癢持續時間

采用攝像、計時器等儀器分別對藥物組和對照組造模后出現瘙癢反應的潛伏時間以及單次瘙抓持續時間進行記錄，并進行數據處理分析。這兩個指標常結合單位時間內瘙癢次數綜合評價受試藥物的止癢效果。吳春香等［5］等在研究地膚子醇提取物止癢效果時就使用上述方法和指標。

2.3 致癢劑的致癢閾劑量

采用非定量給予致癢劑的方式造模，以致癢劑使用次數、致癢劑總量等指標作為評價指標，最常采用磷酸組胺誘導的豚鼠瘙癢模型。王雪蘭等［6］在研究葎草水提取物止癢作用時先將涂藥后的各組豚鼠后肢用細砂紙輕輕擦傷，使之發紅，以不出血為度，然后于創面處滴0.25%組胺液，每隔3min滴1次，每次均為0.05ml／只，直至豚鼠出現舔后足為止，將豚鼠首次出現舔右后足時所給予的組胺總量為致癢閾劑量，以各組動物的止癢閾劑量作為評價藥物止癢作用的指標。吳春香等［5］采用該研究方法證實地膚子醇提取物的止癢作用；周然等［7］在蛇床子止癢成分R2的一項實驗中也采取涂藥后于后肢備皮處涂抹磷酸組胺，然后每隔3min以磷酸組胺濃度遞增方式給藥直至出現豚鼠回頭舔后足，并計算磷酸組胺的總量作為致癢閾劑量。

2.4 瘙癢介質的測定

目前有關瘙癢發生的神經生理機制尚未完全闡明，但是國內外在該領域的研究已經取得重大進展。據報道［9］，傳導瘙癢的無髓鞘C纖維廣泛分布于皮膚真皮與表皮，外源性或內源性因素作用于機體時可產生相應的瘙癢介質，后者與神經末梢上的特異性受體結合而產生癢覺神經沖動。目前已確定的瘙癢介質主要包括胺類、蛋白酶、生長因子、神經肽、類阿片物質、十二烷類細胞素等。瘙癢介質測定是研究藥物止癢作用的重要指標。

2.4.1 胺類介質 胺類介質主要有組胺和5－羥色胺，組胺是目前研究最多的瘙癢介質，組胺在體內主要存在于嗜堿性粒細胞和肥大細胞，當細胞受到免疫性和非免疫因素作用時發生脫顆粒釋放組胺，后者與游離神經末梢上的受體發生特異結合而引起癢覺傳導，但是它并不是所有疾病的瘙癢介質［9］。致癢劑4－氨基吡啶誘發小鼠舔體反應與刺激肥大細胞脫顆粒釋放組胺有關［10］，此模型常被應用于藥物止癢機制的探討。周然等［7］用此模型研究蛇床子的止癢作用，采用熒光法測定各組動物皮膚和血清樣本的組胺含量，研究結果顯示藥物組的組胺含量明顯低于對照組并有統計學意義，證實了蛇床子止癢有效成分的作用機理可能與其穩定肥大細胞膜、抑制皮膚肥大細胞脫顆粒釋放組胺有關。

2.4.2 白細胞介素 業已證實白細胞介素IL－2、IL－4、IL－6能引起瘙癢反應，在轉基因鼠中高表達IL－4可引發類似人類特異性皮炎的瘙癢性皮膚病［9，11］。我國學者王暉等［10］采用組胺和4－氨基吡啶聯用建立瘙癢動物模型，小鼠眼球取血用試劑盒測定小鼠血清中組胺、INF－γ和IL－6的濃度綜合作為評判模型優劣的指標之一，結果表明，瘙癢次數多的實驗組血清中上述介質濃度顯著高于瘙癢次數少的實驗組。巫冠中等［12］在探討黃酮類活性組分的止癢活性時用氯喹給小鼠全身造模后取各組小鼠血清樣本，用免疫組化方法測定IL－4含量，結果證實藥物組的IL－4的含量低于模型組，且具有統計學意義。

2.4.3 其它介質 P物質、INF－γ、TNF－α等亦可作為瘙癢介質。P物質是一種含11個氨基酸殘基的多聚肽，屬于速激肽家族，存在于神經末梢纖維內，與NK－1受體結合而引起癢覺傳導。多位學者［13－15］曾報道，在變應性接觸性皮炎 （ACD）伴發的瘙癢機制研究中組胺和5－羥色胺可能不起主要作用，P物質通過與神經肽受體結合而發揮生物學效應。在其它類型瘙癢中，C類神經被激活后可導致神經肽P物質的釋放，后者加速肥大細胞脫顆粒釋放組胺。

2.5 病理形態學檢查

在瘙癢動物模型觀察瘙癢行為之后，立即剪取模型小鼠注射致癢劑周圍2cm×2cm大小面積的皮膚，初步去除皮下結締組織，放入10%的甲醛溶液中固定保存，然后制成常規病理切片。瘙癢反應的病理學改變主要有：局部毛細血管內皮細胞收縮，毛細血管通透性增加以及炎性成分的滲出，炎性細胞的聚集、增生與浸潤。

王暉［10］采用組胺和4－氨基吡啶聯用建立瘙癢動物模型，在該模型動物皮膚樣本中發現以中性粒細胞為主的炎性細胞分布更密集，間質水腫更明顯，結合瘙癢反應次數及致癢介質濃度測定結果綜合判斷，表明聯合方案建立的動物模型瘙癢行為更明顯。

巫冠中［12］研黃銅類止癢活性，探討該藥物抑制肥大細胞脫顆粒和組胺釋放的作用。選用SD小鼠作為實驗動物，經腹腔灌洗收集肥大細胞，并按相應的細胞生物學方法經系列處理得到濃縮的單層細胞液，隨機收取100個細胞用1%中性紅溶液染色，計數其中脫顆粒的肥大細胞。評判的標準包括細胞邊緣的完整性消失；細胞顆粒狀物的釋放。

3 超敏反應動物模型在止癢藥物研究中的應用

超敏反應動物模型的炎癥反應程度可用于評價藥物止癢效果，在超敏反應動物模型上測定藥物組與對照組的局部腫脹度或單位面積重量作為評價指標。周然等［7］將實驗組涂藥、對照組涂賦形劑后用DNCB（2、4－二硝基氯苯）引發小鼠遲發型超敏反應，各組小鼠以1%DNCB（空白對照組用乙醇）0.1ml均勻涂于脫毛區皮膚致敏，次日起各組背部脫毛區涂抹相應的藥物，1次／d，連續5d，于致敏后第5天，各組小鼠以1%DNCB 0.1ml均勻涂于右耳內外兩側以激發，24h后脫臼處死，用打孔器取下兩耳相同部位相同面積的耳片稱重，以左右耳片重量差值為腫脹度，計算出腫脹率，統計結果表明給藥組的腫脹率明顯低于對照組。王雪蘭［6］亦采用該方法探討葎草水提取物的止癢效果。

4 小結與展望

止癢藥物藥理作用在動物實驗研究階段常以瘙癢行為為主要甚至為唯一指標。但在動物瘙癢行為的觀察上因瘙癢行為的標準難于統一導致主觀上的誤差，同時也有客觀上的誤差，如以小鼠為實驗動物對象，小鼠在安靜無刺激因素的狀態下出現自發性的瘙癢行為動作也較常見［15］。甚至有的學者建立的動物模型本身就不能很好的模擬人類的瘙癢癥狀［1］，kuraishi經典的瘙癢模型就不能很好的區分疼痛和瘙癢引起的瘙抓動作［16］。我們總結了評價藥物止癢效果的常用方法與指標，具體使用時應以瘙癢動物模型的瘙癢行為記錄為基礎，再聯用其它方法與指標。鑒于瘙癢往往是多因素引起的多種瘙癢介質參與的病理癥狀，有學者在建立瘙癢動物模型時同時采用幾種致癢物質建立動物模型而非單一物質制造的動物模型似乎更合理［10］。