葫蘆科蔬菜未受精子房離體培養的研究進展

李玲 ，唐炎英 ，閔子揚 ，童龍 ，肖璐 ，李涵 ，孫小武 ，2

（1.湖南農業大學，長沙，410128；2.湖南省瓜類研究所）

葫蘆科作物包括黃瓜、南瓜、西瓜、西葫蘆等常見的蔬菜和瓜果，是世界上重要的食用植物科之一，其重要性僅次于禾本科、豆科和茄科作物。長期以來，西瓜常規育種周期長、工作量大、遺傳性狀不穩定等因素在很大程度上限制了西瓜的育種進程。單倍體經自然或者人工加倍可得到純合二倍體，這對異花授粉作物和雜交后代來說意義非常重大。一方面，單倍體育種大大縮短了二倍體的純合時間，從而減少了育種年限；另一方面還能克服遠緣雜交不親和，提高誘變育種效率以及合成育種新材料。但是，葫蘆科作物自發產生單倍體的頻率極低，不能滿足育種工作的需要，所以研究者嘗試通過雄核和雌核離體培養兩個途徑來誘導單倍體。目前葫蘆科作物通過雄核離體培養生產單倍體難度較大，采用雌核離體培養（未授粉的胚珠或子房）來獲得單倍體植株，是在較短時間內獲得高度純合二倍體快速且有效的方法。到目前為止，通過未授粉子房或胚珠離體培養在葫蘆科的黃瓜、甜瓜、南瓜、苦瓜、西葫蘆上已成功獲得了單倍體植株，這對于葫蘆科作物的育種有著十分重要的意義[1]。

1 未受精子房離體培養的國內外研究進展

未受精子房離體培養的目的就是為了得到單倍體植株，自1921年意大利植物學家Blakesly在自然界中發現曼陀羅的單倍體植株以來，許多研究者都想利用單倍體加倍獲得純系，從而達到迅速穩定雜種的目的。未授粉子房的離體培養是獲得單倍體植株的有效途徑之一。20世紀50年代末就開始有人離體培養未授粉的子房，并試圖通過此途徑誘導單倍體，但是都沒有成功。直到1976年，San Noeum[2]首次報道在小麥未受精子房離體培養試驗中獲得單倍體植株。此后，國外的育種工作者一直在研究單倍體育種并試圖完善其途徑，已經在許多植物種類上成功得到單倍體并應用于新品種的培育。國內從20世紀70年代才開始進行這方面的工作，直到80年代，我國的雌核離體培養研究出現了第一個高峰，并在水稻、小麥、大麥、玉米、煙草等作物上，獲得了單倍體及自然加倍的雙單倍體植株。在葫蘆科上，杜勝利[3]成功地在黃瓜未受精子房的離體培養研究上得到了單倍體植株，并已將研究應用到黃瓜的新品種選育上。Gémesné等[4]利用未授粉子房離體培養成功獲得了單倍體植株。Ficcadenti等[5]運用與Gémesné等相似的培養方法在甜瓜未受精子房離體培養中也獲得了單倍體植株。2009年，葛志東[6]在西葫蘆未受精子房的培養中也同樣得到了再生單倍體植株。迄今為止，雖然未受精子房的離體培養在一些植物中已獲得單倍體植株，但仍然有多種作物沒有突破，這一途徑也存在著許多問題，為了更好地將相關的研究成果應用到育種工作中，應進行進一步深入研究。

2 影響西瓜未受精子房離體培養的主要因素

葫蘆科未授粉子房離體培養誘導單倍體的影響因素很多，主要有供體植株的基因型、胚囊的發育時期、供體的生長季節、外植體的預處理和預培養、培養基及激素的添加和培養條件等。

2.1 基因型

供體植株的基因型是影響未受精子房胚胎發生的重要因素之一已被廣泛證實，有些植株的子房只對特定的培養基有反應[7]。杜勝利[3]以生長在同一春大棚中的津春3號和津雜2號黃瓜品種為試材，同期取未受精子房在培養基上進行離體培養，發現津春3號的胚芽和愈傷誘導率均高于津雜2號。同樣裴曉利等[8]將9種不同基因型黃瓜的子房切片接種到誘導培養基上，得出各材料單倍體誘導率變化幅度為65.52%～93.33%。這可能因不同材料的未受精子房對離體培養的敏感度不同，因此，選擇合適的基因型是植物未授粉子房離體培養成功的關鍵。

2.2 胚囊發育時期

胚囊發育時期對胚狀體的誘導至關重要。許多研究表明，處于成熟胚囊期即開花當天的未受精子房，其胚狀體誘導率、成苗率均最高[9，10]。這可能是花器內源激素的水平在開花當日達到較高水平的緣故。但在黃瓜試驗中發現，開花前1～4 d的子房均可誘導獲得胚芽，但以開花前2～3 d的子房胚芽誘導率最高[11，12]；同樣，葛志東[6]和孫守如等[13]發現，開花前1 d的西葫蘆子房和胚珠已成熟或接近成熟，易于被誘導。故不能僅憑開花時間來判斷胚囊發育時期，因為胚囊發育會因植株生長狀況及采花時期不同而不同，開花天數相同胚囊發育時期也不盡相同。

2.3 供體的生長季節

供體材料的生長季節對胚狀體的誘導有一定的影響，不同播期的材料其胚狀體發生頻率差異極顯著。盛慧[14]的試驗表明，秋季生長的黃瓜材料誘導率要高于春季，且不易污染，冬季的誘導效果一般。同樣陳解放[9]在南瓜上也得出胚狀體發生和小苗的誘導集中在 7月中旬和8月中旬。Przyborowski等[15]也在黃瓜單倍體誘導中發現，春季材料的誘導率很低，僅是夏季材料誘導率的1/4。說明季節對未受精子房離體培養的影響是顯著的。

2.4 外植體的預處理和預培養

未受精子房接種之前采用適當的方法進行預處理，或在接種后進行適當的預培養能夠提高其培養效果。

①低溫預處理 周林[16]將2個供試材料置于4℃低溫預處理24～96 h，發現預處理72 h效果最好，2個材料誘導率分別達到了49.34%和60.57%。王文和[17]在試驗中得出，4℃低溫處理2 d草莓離體誘導效果最佳，隨著時間延長誘導率緩慢下降。但是Gémesné等[4]發現，低溫預處理對黃瓜未受精子房的誘導效果不明顯，雖然低溫預處理廣泛用于葫蘆科、十字花科等作物的大孢子培養，但其作用機理仍無具體定論。

②高溫預培養 高溫預培養對于啟動雌核發育有相當重要的作用，在有些材料上不進行預培養就不能形成胚狀體[4]。徐靜[7]、郭永強[12]在試驗中發現，35℃黑暗熱激5 d對啟動西葫蘆雌核發育有積極的作用，胚珠轉綠的百分率可達90.5%。同樣，Gémesné等[4]在黃瓜上也發現經過35℃熱激處理效果最好，誘導率達18.4%。這可能與子房在熱激前后的生理性狀不同有關。

2.5 培養基

培養基是雌核誘導單倍體過程中的重要影響因素，培養基的影響涉及到基本培養基的種類、碳源的種類及濃度、外源激素的種類及濃度等諸因素。

①基本培養基 目前未受精子房的離體培養多采用MS基本培養基或其改良型。韓麗華[18]在厚皮甜瓜試驗中選用MS培養基獲得了單倍體植株。杜勝利[3]則選用了1/2 MS培養基對黃瓜未受精子房進行培養，并成功獲得了單倍體植株。然而，Kantartzi等[19]在研究中發現基本培養基H和MS沒有明顯的區別。那么究竟用何種培養基，必須經過充分的比較試驗才能確定，很難一概而論。

②培養基中的添加物 a.激素。基本培養基只有配合使用適當的外源激素，才能更好地誘導愈傷組織、胚狀體的形成以及芽、根的分化。有研究表明，培養基中不加任何外源激素不能誘導子房的膨大和雌核發育[20]。葛志東[6]以西葫蘆為對象研究了激素對未授粉子房離體培養的影響，結果表明，NAA、6-BA和 2，4-D是誘導雌核發育的3種理想的外源激素，以 3 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L NAA+1mg/L 6-BA的組合誘導效果最好。Li等[21]認為在基礎培養基中加入0.03～0.07 mg/L的TDZ效果最佳，胚珠誘導率高達7.85%～12.14%。杜勝利[3]在黃瓜試驗中也得出，在僅加細胞分裂素不加生長素的培養基上可以誘導出更多正常的胚芽。所以在試驗中我們應該根據需要來選擇合適的激素及激素濃度。

b.活性炭。活性炭能吸附培養基中的有害物質，給胚珠和子房創造更好的發育環境。Van等[22]和Gürel等[23]在試驗中發現培養基中未添加活性炭的甜菜誘導率很低。而周林[16]在西瓜試驗中得到了相反的結果。這可能因為活性炭的吸附沒有選擇性，在吸附培養基中的有害物質的同時也吸附了一些大量、微量元素和其他有用成分。所以在實際操作中應該嚴格控制活性炭使用量。

c.碳源。碳源不僅能給外植體提供能量，而且也能維持一定的滲透壓。許多研究表明，3%～4%的蔗糖濃度適合未授粉子房的誘導[7]。在添加了40 g/L蔗糖的培養基中，西瓜未受精子房愈傷組織誘導率最高，分別達到了47.34%和53.14%[16]。杜勝利[3]在蔗糖對黃瓜雌核發育影響的試驗中發現，在30 g/L蔗糖條件下效果最好。

d.AgNO3。韓麗華[18]首次將AgNO3應用于厚皮甜瓜雌核離體誘導，發現AgNO3濃度為80 mg/L時，胚狀體誘導率最高，為0.74%。裴曉利等[8]發現在誘導培養基中添加AgNO3能顯著提高黃瓜雌核發育啟動率。

2.6 培養條件

許多試驗表明，培養溫度白天28℃左右，夜間25℃左右，光照強度1 500～2 000 lx，每天光照16 h誘導率最高[16，23]。同樣楊穎[24]在西瓜上發現25℃暗培養4 d后再進行光暗交替培養效果最佳。而王璐等[25]在黃瓜試驗中發現，經過25℃暗培養處理1 d，啟動雌核發育的反應率最高，達91.3%。總之，各種培養條件對不同植物的離體雌核發育有著不同的影響，但在葫蘆科方面，大部分研究證明，前期暗培養約一周，后期采取恒光恒溫的培養方式效果最佳。

3 再生植株倍性鑒定及染色體加倍

3.1 再生植株的倍性鑒定

葫蘆科作物通過單倍體誘導獲得的再生植株，往往是既有單倍體也有雙單倍體，甚至還有混倍體的，因此有效的倍性鑒定是其進一步應用于育種的基礎。目前鑒定植株倍性的方法主要有：形態學鑒定法、染色體計數法、流式細胞儀鑒定法、氣孔保衛細胞鑒定法。

①形態學鑒定法 因單倍體植株在正常生長狀態下常比其二倍體弱小，所以利用形態學特征在幼苗期可以目測選出大部分單倍體。這種方法比較直觀、便捷，但是耗時長。

②染色體計數法 是確定植物染色體倍性最基本和最精確的一種方法，通常以根尖或子房為材料，通過顯微鏡觀察染色體數目來確定植株倍性。

③流式細胞儀鑒定法 是用特異的DNA熒光染料對細胞染色，然后測定樣品的熒光密度，熒光密度與DNA含量呈正比。這種方法快速、簡便、準確，但是價格昂貴。楊穎[24]在西瓜未受精子房的離體培養的試驗中利用流式細胞儀鑒定了再生植株的倍性。Gémesné等[4]在黃瓜研究中也利用流式細胞儀檢測到87.7%的再生植株為單倍體。

④氣孔保衛細胞鑒定法 是依據氣孔保衛細胞的長度、葉綠體數目、單位面積內的氣孔數目等的不同進行植株倍性鑒定。謝冰等[26]選用此方法初步確定了西葫蘆植株的倍性。

3.2 染色體加倍

單倍體植株只有加倍成純合的二倍體才能在實際育種中應用。單倍體植株在生長發育過程中，可以自然加倍成雙單倍體，但是頻率一般比較低，而且加倍頻率受試材基因型的影響，所以需要采用人工加倍方法來滿足育種實踐的要求。到目前為止，大多數試驗是利用秋水仙堿誘導單倍體。秋水仙堿處理方法有：浸漬法、涂抹法、滴液法等，其中浸漬法是主要的方法。杜勝利[3]采用秋水仙堿浸泡處理黃瓜植株后，其成活率大大提高，且變異率達33.3%和41.7%，加倍率為4.1%。

4 問題及展望

4.1 存在的問題

通過未受精子房的離體培養誘導單倍體在很多物種中已得到應用，但這種方法還不能普遍應用在所有重要栽培作物中。特別是在西瓜未受精子房離體培養上，誘導體系還不完善，誘導率也不高。即使成功誘導出單倍體植株，也存在如何將誘導率穩定下來，如何選擇最好的再生植株倍性鑒定方法及胚囊植株加倍方法等問題，所以還需要進行大量的試驗研究。

4.2 展望

通過未受精子房的離體培養獲得單倍體，避免了育種工作中繁瑣的多代自交程序，能夠快速有效地獲得純合雙單倍體，并且可直接應用于培育新品種或作為優良親本應用于品種改良，從而大大縮短育種年限；通過單倍體加倍可得到高度純合的雙單倍體，被認為是研究分子標記和基因圖譜的極好材料。同時在單倍體和雙單倍體中，所有隱性基因均處于純合狀態，可消除顯性基因的干擾。因此，西瓜未受精子房的離體培養技術在作物遺傳育種的理論和實踐研究中均具有廣闊的應用前景。相信在不久的將來，西瓜未受精子房的離體培養技術能夠逐步完善，能為遺傳育種做出巨大貢獻。

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