杜仲成熟果實和幼果MVA途徑基因表達差異分析

王 淋，烏云塔娜，葉生晶

（1.中南林業科技大學 a.經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室；b.林學院，湖南 長沙 410004；2.中國林業科學研究院 經濟林研究開發中心，河南 鄭州 450003；3.國家林業局杜仲工程技術研究中心，河南 鄭州 450003；4.國家林業局中南林業調查規劃設計院，湖南 長沙 410014）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.別名絲楝樹皮、膠樹，為落葉喬木，其在我國的栽培面積占世界總栽培面積的90%以上，是我國特有的經濟林樹種之一[1]。杜仲樹皮為傳統名貴中藥；杜仲葉富含綠原酸、京尼平苷酸等活性成分[2-3]；杜仲種仁中含有α-亞麻酸，其含量為橄欖油、茶油中的α-亞麻酸含量的8～60 倍，而其桃葉珊瑚苷含量高達11.3%，是目前同類植物中含量最高的[4]。此外，杜仲各組織器官中均含有一種重要的工業原料——杜仲膠[5]，杜仲膠的反式聚異戊二烯結構使其具有良好的絕緣性和粘著性，因而被廣泛應用于電器工業、化學工業和電信器材工業，故其被譽為具有良好橡塑二重性的高分子合金材料，是目前最具開發價值的溫帶膠資源[6]。

萜類物質是植物次生代謝過程中重要的代謝產物，因其結構類型豐富多樣而被稱為“terpenome”[7]。杜仲膠的主要化學成分為聚異戊二烯，屬于多萜類化合物[8]。而植物萜類化合物主要通過兩個途徑獨立合成，即位于細胞質的甲羥戊酸（MVA）途徑和位于質體中的甲基赤蘚醇4-磷酸（MEP）途徑[9]。作為植物萜類生物合成的重要上游調控路徑之一的MVA途徑是一個不可逆的過程：2個乙酰輔酶A（acetyl-CoA）在乙酰輔酶A轉移酶 （acetoacetyl-CoA acethyltransferase,ACOT） 的作用下合成乙酰乙酰輔酶A（acetoacetyl-CoA），經3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（hydroxymethylglutaryl-CoA synthase,HMGS）的催化形成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A （3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A, HMGCoA），再經3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（hydroxymethylglutaryl-CoAreductase,HMGR） 的催化下生成甲羥戊酸（mevalonate, MVA），之后在MVA激酶（mevalonate kinase,MK）的作用下形成磷酸甲羥戊酸（mevalonate-5-phosphate,MVAP），接著在磷酸甲羥戊酸激酶（phosphomevalonate kinase,PMK）的作用下生成焦磷酸甲羥戊酸（mevalonate-5-diphosphate,MVAPP）， 最 終 在甲羥戊酸焦磷脫羧酶（mevalonatepyrophosphate decarboxylase,MPD） 的作用下生成萜類物質合成前體異戊烯焦磷酸（Isopenteny, IPP）[10-13]。

本文確定了杜仲幼果和成熟果實在MVA途徑中的相關基因，并對這些基因表達量的差異情況進行了分析，為充分挖掘杜仲膠的生物合成過程中潛在的功能基因，深入了解合成途徑中的限速步驟，解析杜仲萜類生物合成的分子機理以及為確定杜仲萜類代謝工程靶點提供了基礎信息。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取國家林業局泡桐研究開發中心“華仲6號”的杜仲幼果（授粉后50 d，杜仲膠合成第一個高峰期）、杜仲成熟果（授粉后210 d，杜仲膠合成第二個高峰期）和杜仲葉子（展葉后55 d，膠含量高）作為實驗材料，洗凈后投入液氮中，于－80 ℃下保存以備用。

1.2 杜仲樣品RNA的提取

采用Omega公司的Plant RNA Kit試劑盒提取杜仲葉片中的總RNA，提取完畢后測定樣品A260與A280的數值，根據A260/A280的比值估測RNA的質量，然后將能滿足實驗要求的RNA樣品用干冰保存好，再將其送至深圳華大基因公司進行轉錄組測序和基因功能注釋。

1.3 轉錄組測序方法

深圳華大基因公司對目的樣品的濃度及完整度進行了檢測，符合測序要求后，采用Illumina技術開始上機測序，通過OligodT富集mRNA，并收集200～700 nt的片段；以隨機引物為接頭，將mRNA反轉錄cDNA；按照長度對合成的cDNA片段進行分類，并進行PCR擴增；對獲得的PCR產物進行Illumina測序[14-15]。

1.4 Unigene功能注釋方法和流程

本研究對杜仲果實的轉錄組進行了測序，構建了轉錄組數據庫，然后對數據庫中的Unigene進行了全面分析和注釋。功能注釋信息給出了各Unigene的蛋白功能注釋、Pathway注釋、Gene Ontology（GO）基因功能的注釋，具體流程如圖1 所示[14-15]。

圖1 數字化轉錄組數據庫的分析流程Fig.1 Analysis process of digital transcriptome data

2 結果與分析

在杜仲幼果和成熟果實轉錄組數據中，MVA合成途徑共有6個代謝位點、30條Unigene被注釋（詳見圖2）。其中，代謝位點2.3.1.9為乙酰輔酶A轉移酶（acetyl-CoA C-acetyltransferase,ACOT），共注釋7條；代謝位點2.3.3.10為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（hydroxymethylglutaryl-CoA synthase,HMGS），共注釋3條；代謝位點1.1.1.34為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（hydroxymethylglutaryl-CoA reductase,HMGR），共注釋11條；代謝位點2.7.1.36為甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase,MK），共注釋2條；代謝位點2.7.4.2為磷酸甲羥戊酸激酶（phosphomevalonate kinase,PMK），共注釋2條；代謝位點4.1.1.33為甲羥戊酸焦磷脫羧酶（diphosphomevalonate decarboxylase,MDP），共注釋5條。

圖2 杜仲幼果和成熟果實KEGG數據庫中的MVA途徑Fig.2 MVA pathway of young and ripe fruits in KEGG Data

2.1 杜仲乙酰輔酶A轉移酶EuACOT的確定及其表達差異分析

杜仲乙酰輔酶A轉移酶在杜仲幼果和成熟果實的轉錄組數據中共有7條被注釋，這些基因的編碼序列與煙草Nicotiana tabacum（AAU95619.1）、胡黃連Picrorhiza kurrooa（ABC74567.1）、油茶Camellia oleifera（ADD10719.1）、伊樂假單胞菌Sphingomonas elodea（ZP_09954590.1） 的 ACOT基因的氨基酸序列同源性均達到80%以上，故被命名為EuACOT，記為EuACOT1～7。

EuACOT在杜仲果實中的表達量見圖3。EuACOT7在杜仲幼果中不表達，只在成熟果實中表達，而其他EuACOT成員在杜仲幼果和成熟果實中均有表達，且其在幼果中的表達量大于在成熟果實中的表達量，這說明，EuACOT7為杜仲果實生長發育的晚期基因。

圖3 EuACOT 在杜仲幼果和成熟果實中表達的差異情況Fig.3 Differential expression of EuACOT in young and ripe fruits

EuACOT在杜仲幼果和成熟果實中表達的多樣性如表1。EuACOT2、EuACOT3、EuACOT4、EuACOT5、EuACOT6在杜仲幼果和成熟果實中的表達量均存在顯著差異，EuACOT在幼果中的表達量的大小順序為EuACOT4＞EuACOT5＞EuACOT3＞EuACOT6＞EuACOT2＞EuACOT1＞EuACOT7；而在成熟果中，EuACOT4和EuACOT5基因的表達量較高。幼果中的基因表達量比成熟果實中的表達量相對高很多，說明幼果的遺傳多樣性比成熟果高很多，其表達調控模式較為復雜。

表1 EuACOT在杜仲幼果和成熟果中表達的多樣性Table 1 Diversity of EuACOT expression in young and ripe fruits

2.2 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶EuHMGS的確定及其表達差異分析

在杜仲幼果和成熟果實中共有3條EuHMGS基因被注釋，這些基因編碼序列與喜樹Camptotheca acuminate（ACD87446.1）、煙草屬觀賞煙Nicotiana langsdorf fi ixNicotiana sanderae（ABV02025.1）的HMGS基因的氨基酸序列的同源性均達到了83%～89%，記為EuHMGS1～3。

EuHMGS基因在杜仲幼果和成熟果實中的表達量見圖4。EuHMGS家族成員在杜仲幼果和成熟果實中均有表達，且幼果中的表達量均大于成熟果實中的表達量。

圖4 EuHMGS 在杜仲幼果和成熟果實中表達的差異情況Fig.4 Differential expression of EuHMGS in young and ripe fruits

EuHMGS在杜仲幼果和成熟果中表達的多樣性如表2。EuHMGS1、EuHMGS2、EuHMGS3等基因在幼果和成熟果實中的表達量均存在顯著差異，無論在幼果還是成熟果實中其表達量的大小順序均為EuHMGS1＞EuHMGS2＞EuHMGS3。

表2 EuHMGS在杜仲幼果和成熟果中表達的多樣性Table 2 Diversity of EuHMGS expression in young and ripe fruits

2.3 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶EuHMGR的確定及其表達差異分析

在杜仲幼果和成熟果實的轉錄組數據中共有11條EuHMGR基因被注釋，這些基因編碼序列與喜樹Camptotheca acuminata（P48021.1）、馬鈴薯Solanum tuberosum（P48020.1）、黃龍膽Gentianalutea（BAE92730.1）等其他植物的HMGR基因的氨基酸序列的同源性均達到80%以上，故其被命名為EuHMGR，記為EuHMGR1～11。

EuHMGR在杜仲幼果及成熟果實中的表達量如圖5所示。從圖5中可以看出，EuHMGR4、EuHMGR5基因在杜仲成熟果實中不表達，只在杜仲幼果中有特異表達，說明EuHMGR4、EuHMGR5基因為杜仲果實生長發育的早期基因；EuHMGR10在幼果中不表達，只在成熟果實中有特異表達，說明EuHMGR10為杜仲果實生長發育的晚期基因，也是萜類物質大量合成時表達的基因。綜上所述，EuHMGR10在萜類化合物的生物合成中起重要作用；且EuHMGR1、EuHMGR8、EuHMGR9在成熟果實中的表達量大于幼果，EuHMGR2、EuHMGR3、EuHMGR6、EuHMGR7、EuHMGR11等基因在幼果中的表達量大于其在成熟果實中的表達量。

圖5 EuHMGR 在杜仲幼果和成熟果實中表達的差異情況Fig.5 Differential expression of EuHMGR in young and ripe fruits

EuHMGR在杜仲幼果和成熟果實中表達的多樣性如表3所示。由表3可知，EuHMGR3、EuHMGR4、EuHMGR5、EuHMGR6、EuHMGR7、EuHMGR9、EuHMGR11在杜仲幼果和成熟果中的表達量無顯著差異，而EuHMGR1、EuHMGR2、EuHMGR8、EuHMGR10在杜仲幼果和成熟果實中的表達量存在顯著差異，這說明，EuHMGR基因表達調控模式極其復雜。

2.4 甲羥戊酸激酶EuMK的確定及其表達差異分析

從杜仲幼果和成熟果實轉錄組數據中可以發現，EuMK基因有2條被注釋，這些基因編碼序列與擬南芥Arabidopsis thaliana（AAD45421.1）和橡膠樹Hevea brasiliensis（AAL18925.1）等植物的MK基因的氨基酸序列的同源性均達到80%以上，故其被命名為EuMK，記為EuMK1～2。

表3 EuHMGR在杜仲幼果和成熟果中表達的多樣性Table 3 Diversity of EuHMGR expression in young and ripe fruits

EuMK在杜仲幼果與成熟果實中均有表達（見圖6），且在幼果中的表達量大于在成熟果實中的表達量。

圖6 EuMK 在杜仲幼果和成熟果實中表達的差異情況Fig.6 Differential expression of EuMK in young and ripe fruits

EuMK在杜仲幼果和成熟果實中表達的多樣性如表4所示。由表4可知，EuMK在杜仲幼果和成熟果實中的表達量均存在顯著差異。

表4 EuMK在杜仲幼果和成熟果中表達的多樣性Table 4 Diversity of EuMK expression in young and ripe fruits

2.5 磷酸甲羥戊酸激酶EuPM的確定及其表達差異分析

從杜仲幼果和成熟果實的轉錄組數據中發現，EuPMK基因有2條被注釋，這些基因編碼序列與煙草屬觀賞煙Nicotiana langsdorf fi ixNicotiana sanderae（ABV02027.1）、橡膠樹Hevea brasiliensis（AAL18926.1）、 茶Camellia sinensis（AFC34137.1）等植物的MK基因的氨基酸編碼序列的同源性分別為83%、77%、90%，故其被命名為EuPMK，記為EuPMK1與EuPMK2。

EuPMK在杜仲幼果和成熟果實中均有表達（見圖7），EuPMK1與EuPMK2在杜仲幼果中的表達量均大于其在成熟果中的表達量。

圖7 EuMDP在杜仲幼果和成熟果實中表達的差異情況Fig.7 Differential expression of EuMDP in young and ripe fruits

EuPMK在杜仲幼果和成熟果中表達的多樣性如表5所示。由表5可知，EuPMK1在杜仲幼果和成熟果實中的表達量均存在顯著差異，而EuPMK2在杜仲幼果和成熟果實中的表達量卻無顯著差異。

表5 EuPMK在杜仲幼果和成熟果中表達的多樣性Table 5 Diversity of EuPMK expression in young and ripe fruits

2.6 磷酸甲羥戊酸激酶EuMDP的確定及其表達差異分析

從杜仲幼果和成熟果實的轉錄組數據中發現，EuPMK基因有5條被注釋，這些基因編碼序列與人參Panax ginseng（ADI80345.1）、橡膠樹Hevea brasiliensis（AAL18927.1）、煙草屬觀賞煙Nicotiana langsdorf fi ixNicotiana sanderae（ABV02028.1）等植物的MDP基因的氨基酸序列的同源性均達到85%以上，故其被命名為EuMDP，記為EuMDP1～5。

EuMDP在杜仲幼果和成熟果及杜仲幼果和葉子中均有表達（詳見圖8），EuMDP家族各成員在杜仲幼果中表達量的大小順序為EuMDP2＞EuMDP5＞EuMDP3 ＞EuMDP4＞EuMDP1；而在杜仲成熟果中，EuMDP3和EuMDP4的表達量相對較高。

圖8 EuMDP在杜仲幼果和成熟果實中表達的差異情況Fig.8 Differential expression of EuMDP in young and ripe fruits

EuMDP在杜仲幼果和成熟果中表達的多樣性如表6所示。由表6可知，EuMDP家族其他成員在幼果和成熟果實中的表達量均達到顯著差異水平。

表6 EuMDP 在杜仲幼果和成熟果中表達的多樣性Table 6 Diversity of EuMDP expression in young and ripe fruits

3 結論與討論

萜類化合物（terpenoids）是植物次生代謝產物中最大的一個家族，在自然界中廣泛分布，但一般萜類物質在植物中的含量較低，難于分離純化，例如，紫杉醇在紫杉樹皮中的含量每千克只有40～100 mg[16]。本研究采用轉錄組測序方法，可以檢測到MVA途徑低表達量的基因的存在，這為進一步分離、純化和克隆萜類物質合成相關酶提供了依據。

萜類化合物生物合成途徑迄今已基本闡明，主要為通過細胞質中的MVA途徑和質體中 的MEP途徑合成，其生物合成中相關酶的克隆、表達和調控是目前研究的熱點。本文確定了MVA途徑的相關基因：EuACOT7條、記為EuACOT1～7；EuHMGS3條、 記 為EuHMGS1～ 3；EuHMGR11條、記為EuHMGR1～11；EuMK2條、記為EuMK1～2；EuPMK2條、記為EuPMK1～2；EuMDP5條、記為EuMDP1～5。

植物體內許多萜烯成分通常有著復雜而獨特的生物合成途徑和迥異的化學結構，其分布通常具有種屬、器官、組織和生長發育階段的特異性[17]，這就充分說明了萜類合成酶存在表達和調控的時空特異性。乙酰COA酰基轉移酶是萜類化合物合成MVA途徑的起始酶，在不同的組織中其表達量有所不同[18]。在丹參的根、莖、葉中均有表達，但是根中的表達量明顯高于莖和葉中的表達量[19]。EuACOT家族基因在杜仲成熟果實中均有表達，除了EuACOT7，其他EuACOT成員在杜仲幼果中均有表達，且其在幼果中的表達量大于其在成熟果實中的表達量。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶是萜類物質合成MVA途徑中重要的中間體，HMGS在不同組織部位的表達不盡相同，例如喜樹HMGS基因在子葉和胚軸中的表達量最高，而在根部幾乎不表達[20]；EuHMGS在杜仲幼果和成熟果實中均有表達，且其在幼果中的表達量大于其在成熟果實中的表達量，并且存在顯著性差異。不同物種MVA途徑關鍵酶基因的克隆與功能的研究多集中于3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，HMGR是MVA途徑中的第一個限速酶，為細胞質萜類代謝中的重要調控位點。Schaller等人[21]將HMGR的基因組片段hmg1基因轉入煙草中，使總的甾醇量增加6倍，其原因可能是hmg1表達水平的提高導致了相應的HMGR酶活性的提高，并且最終產物在轉基因的組織中得以累積。本文對EuHMGR基因在杜仲幼果和成熟果實中表達量的差異情況進行了分析，結果發現，EuHMGR4、EuHMGR5只在杜仲幼果中有特異表達，EuHMGR10只在成熟果實中有特異表達，EuHMGR1、EuHMGR2、EuHMGR3、EuHMGR6、EuHMGR7、EuHMGR8、EuHMGR9、EuHMGR11在杜仲幼果和成熟果實中均有表達。由此可見，EuHMGR表達調控模式較為復雜。EuMK、EuPMK、EuMDP家族基因在杜仲幼果和成熟果中均有表達，且其在幼果中的表達量高于其在成熟果實中的表達量。

本文首次對杜仲幼果和成熟果實MVA途徑相關基因表達的差異情況進行了分析，分析結果為以后研究杜仲萜類物質的生物合成機制提供了理論依據。

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