葡萄WRKY轉錄因子家族全基因組分析

李成慧，蔡 斌

（1.蘇州農業職業技術學院，江蘇 蘇州 215008；2.南京農業大學 園藝學院，江蘇 南京 210095）

轉錄因子（transcription factors）在植物的生長發育及其對外界環境的反應中起著重要的調控作用。轉錄因子通過與基因啟動子區域特異性結合，激活或抑制下游基因的轉錄，在信號傳導和誘導下游相關功能基因表達中起著關鍵作用[1-2]。大部分的轉錄因子是以多基因家族的形式存在的。WRKY基因家族是植物中的一類重要轉錄因子家族。WRKY轉錄因子是鋅指蛋白家族的一個亞家族，其N端包含一個由50個氨基酸組成的高度保守的結構域。WRKY轉錄因子結構域中的N端因有高度保守的7個氨基酸特征序列WRKYGQK而得名，其C末端為一個鋅指結構。WRKY基因家族主要存在于植物中，在植物的生長和發育、環境信號刺激及其對病原物的防御反應過程中發揮著非常重要的作用（如損傷反應[3]、種子發育[4]、葉片衰老[5]、調控植物防御反應相關基因[6]等方面的作用）。WRKY基因還參與植物的抗非生物脅迫（如干旱[7-8]、高鹽[9]、高溫[10]等）反應。

葡萄在世界果樹生產中占有重要的位置，具有很高的經濟價值[11]。葡萄為完成全基因組測序的第一種水果作物和第四種開花植物[12]。有關葡萄WRKY轉錄因子的研究起步較晚，有關葡萄抗生物和非生物脅迫反應方面的研究有個別報道[13]。目前對葡萄WRKY轉錄因子的系統分析和功能研究還未見報道，因此，文中以12×葡萄基因組蛋白序列為數據來源，在全基因組水平上識別和分析WRKY基因家族，對其進行了系譜發生、共線性和表達譜等方面的分析，以期為進一步開展葡萄WRKY轉錄因子基因家族的基因功能和分子進化機制的研究奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 數據收集

從 CRIBI Genomics（http://genomics.cribi.unipd.it）中下載歐亞種Vitis viniferaL.黑比諾PN4002全基因組的注釋序列。從Pfam數據庫（http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/） 中下載WRKY結構域的隱馬可夫模型（HMM）PF03106。

1.2 數據庫搜索

用 HMMER3（http://hmmer.janelia.org/）軟件包以PF03106隱馬可夫模型對葡萄蛋白組進行搜索，所用選項為“cut_ga”。將得到的基因提交到NCBI上的保守結構域數據庫CCD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）中搜索WRKY結構域進行驗證。

1.3 系譜發生分析

用WRKY基因的全長氨基酸序列作多序列聯配，所用軟件為ClustalX2，參數使用默認值。根據多序列聯配的結果，使用MEGA5[14]軟件構建系統發生樹，所用算法為鄰近法(neighbor joining,NJ)，對構建的樹進行自舉檢驗，重復設為1 000。

1.4 共線性檢測

所用軟件為MicroSyn[15]，采用該軟件檢測各基因所在基因組區段之間同源基因在數量和順序上的保守程度。文中每個基因組區段包含100 個基因，在其中間位置為WRKY基因。

1.5 表達分析

Illumia RNA-Seq數 據 從NCBI的GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）中下載，登陸號為GSE37743。表達量的單位以RPKM表示, 即每百萬個測序片段（reads）中每個基因在1 kb長度上所對應的片段數。數據經log 2轉換后提取WRKY基因的表達數據，制作熱圖（heatmap）。

2 結果與分析

2.1 葡萄WRKY基因的鑒定結果

以WRKY基因的HMM在葡萄全基因組蛋白序列中進行搜索，并將搜索到的基因提交到NCBI上的保守結構域數據庫CCD中進行搜索，最后得到55個WRKY基因。根據WRKY基因在染色體上的位置給基因命名，這些基因的名稱詳見表1中的VvWRKY1～VvWRKY55。目前公布的12×葡萄基因組序列被組裝成若干染色體序列，其中“chrN”（N代表染色體的編號，為1～19）表示將相應的序列骨架（contig）按位置和方向定位到染色體N上，無法定位到相應染色體上的序列骨架則組裝到“chrUn”上。54個WRKY基因可以定位到18個染色體上，1個WRKY基因位于chrUn（如圖1所示）。第4號染色體上WRKY基因的數量最多，為8個，第7號染色體上分布的數量次之，為7個，而在第6、9、11和18號染色體上分別只有1個WRKY基因，而第3號染色體上沒有WRKY基因的分布。

2.2 進化分析

為了考察WRKY基因家族在葡萄中的系譜發生關系，在多序列聯配的基礎上，以NJ法構建WRKY基因家族的系譜發生樹。為了更好地對葡萄WRKY基因家族進行分類，我們把葡萄的55個WRKY基因和擬南芥的70個WRKY基因作聯合系譜發生樹（如圖2所示）。根據自舉值的大小（一般＞50%）和擬南芥中WRKY基因的分類信息，將葡萄的55個WRKY基因分為7個亞家族，分別命名為Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe和Ⅲ。其中，Ⅱa和Ⅱb的進化關系較近，Ⅱd和Ⅱe的進化關系較近。

在葡萄和擬南芥的聯合進化樹中，亞家族Ⅱ b包 含VvWRKY37、VvWRKY2、VvWRKY50、VvWRKY42、VvWRKY20、VvWRKY29、VvWRKY35和VvWRKY52等8個基因。利用MircoSyn軟件對包含這些基因的基因組區段進行共線性分析。結果表明，在葡萄基因組內，VvWRKY2、VvWRKY42和VvWRKY50彼此之間存在顯著的共線性關系，區段間所有同源基因對的同義突變率（Ks）平均值也比較相近（如表2）。同樣，VvWRKY29、VvWRKY35和VvWRKY52之間也存在顯著的共線性關系，區段間所有同源基因對的Ks平均值也比較相近。VvWRKY2、VvWRKY42和VvWRKY50分別位于第1、14和17號染色體上，而這3條染色體存在三體（triplet）的關系。據Jaillon等人[12]的研究結果，葡萄基因組內同源區段大部分以三體的形式出現，即一個基因組區域和另外兩個區域存在同源關系，這種基因組三體的特性可能是由于葡萄基因組來源于古代的三個近緣基因組，發生了“古代六倍體化”事件。根據VvWRKY2、VvWRKY42和VvWRKY50之間的共線性關系和系譜發生樹中亞家族Ⅱb成員間的拓撲關系，我們可以推測，位于第1號染色體上的VvWRKY2、第14號染色體上的VvWRKY42及第17號染色體上的VvWRKY50可能在葡萄物種的“古代六倍體化”過程中形成。同樣，位于第10號染色體上的VvWRKY29、第12號染色體上的VvWRKY35及第19號染色體上的VvWRKY52也可能起源于這個“古代六倍體化”過程中。

表1 葡萄WRKY基因的鑒定結果?Table 1 WRKY genes in grape

圖1 葡萄WRKY基因在染色體上的定位圖Fig.1 Chromosomal locations of WRKY genes in grape

圖2 葡萄和擬南芥中WRKY蛋白的聯合系譜發生樹Fig.2 Joined phylogenetic tree of WRKY proteins in grape and Arabidopsis

2.3 表達譜分析

GSE37743包含了葡萄非生物脅迫（紫外線和物理傷害）和生物脅迫（霜霉病侵染）的Illumia RNA-Seq數據，圖3為各處理條件下跟對照相比表達值的熱圖。結果顯示，有9個基因在植物受傷、紫外線照射和受到霜霉病侵染后，基因表達量顯著提高。在這些基因中，有4個基因屬于Ⅱb亞家族，其他5個基因則屬于Ⅱc亞家族。

表2 亞家族Ⅱb內各基因之間的共線性關系?Table 2 Colinear relationships of the genes in Ⅱb subfamily

3 結論與討論

植物轉錄因子在細胞發育、抗逆和信號轉導等方面具有重要作用，而大部分的轉錄因子是以多基因家族的形式存在的。隨著愈來愈多物種全基因組的公布，從全基因組水平上鑒定和分析轉錄因子家族，已成為基因組學研究的重點之一。WRKY轉錄因子家族在植物生長發育和植物防衛機制上具有重要作用。文中利用生物信息學的方法在葡萄全基因組中鑒定了55個WRKY基因，并對其進行了系譜分類和進化分析。系譜分析結果表明，葡萄WRKY基因家族的55個成員可以劃分為7個亞家族。

圖3 葡萄WRKY基因家族在非生物和生物脅迫條件下的表達水平熱圖Fig.3 Heat map of expression of WRKY gene family under different abiotic and biotic stress

在其亞家族Ⅱb中的8個WRKY基因中，VvWRKY2、VvWRKY42和VvWRKY50及VvWRKY29、VvWRKY35和VvWRKY52可能起源于形成葡萄物種的一次“古代六倍體化”過程中；另外2個成員VvWRKY20和VvWRKY37和其他成員間不存在共線性關系，我們推測，VvWRKY20和VvWRKY37可能存在于“古代六倍體化”事件之前。從表達數據來看，VvWRKY20、VvWRKY37、VvWRKY50和VvWRKY52對生物和非生物脅迫的反應，具有相似的表達譜模式（圖3），說明這4個WRKY基因在“古代六倍體化”事件之前已經參與逆境脅迫的調控網絡，而VvWRKY2、VvWRKY42、VvWRKY29和VvWRKY35在進化過程中其表達特性發生趨異分化現象。

參考文獻：

[1] Latchman D S.Transcription factors: an overview[J].Int J Biochem Cell Biol,1997,29(12):1305－1312.

[2] 張 莉,蘇曼琳.植物抗旱基因HDCS1的克隆和表達載體的構建[J].中南林業科技大學學報,2012,32(6):115－117.

[3] Hara K, Yagi M, Kusano T,et al.Rapid systemic accumulation of transcripts encoding a tobacco WRKY transcription factor upon wounding [J].Mol Gen Genet, 2000, 263(1):30－37.

[4] Luo M, Dennis E S, Berger F,et al.MINISEED3 (MINI3), a WRKY family gene, andHAIKU2 (IKU2), a leucine-rich repeat(LRR)KINASEgene, are regulators of seed size inArabidopsis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(48): 17531－17536.

[5] Robatzek S, Somssich I E.A new member of theArabidopsisWRKY transcription factor family, AtWRKY6, is associated with both senescence- and defence-related processes [J].Plant J,2001,28(2):123－133.

[6] Pandey S P, Somssich I E.The role of WRKY transcription factors in plant immunity[J].Plant Physiol, 2009, 150(4):1648－1655.

[7] Wu X, Shiroto Y, Kishitani S,et al.Enhanced heat and drought tolerance in transgenic rice seedlings overexpressing OsWRKY11 under the control of HSP101 promoter [J].Plant Cell Rep,2009,28(1):21－30.

[8] Wang Z, Zhu Y, Wang L,et al.A WRKY transcription factor participates in dehydration tolerance inBoea hygrometricaby binding to the W-box elements of the galactinol synthase(BhGolS1) promoter [J].Planta, 2009,230(6):1155－1166.

[9] Jiang Y, Deyholos M K.Functional characterization of Arabidopsis NaCl-inducible WRKY25 and WRKY33 transcription factors in abiotic stresses [J].Plant Mol Biol, 2009,69(1-2): 91－105.

[10] Li S, Fu Q, Huang W,et al.Functional analysis of anArabidopsistranscription factor WRKY25 in heat stress [J].Plant Cell Rep,2009, 28(4): 683－693.

[11] 彭麗麗,姜衛兵,健 韓.源庫關系變化對果樹產量及果實品質的影響[J].經濟林研究,2012,30(3):134－140.

[12] Jaillon O, Aury J M, Noel B,et al.The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla [J].Nature, 2007, 449(7161): 463－467.

[13] Marchive C, Leon C, Kappel C,et al.Over-expression of VvWRKY1 in grapevines induces expression of jasmonic acid pathway-related genes and confers higher tolerance to the downy mildew [J].PLoS One, 2013, 8(1): 54185.

[14] Tamura K, Peterson D, Peterson N,et al.MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance, and maximum parsimony methods [J].Mol Biol Evol, 2011, 28(10): 2731－2739.

[15] Cai B, Yang X, Tuskan G A,et al.MicroSyn: a user friendly tool for detection of microsynteny in a gene family [J].BMC Bioinformatics, 2011, (12):79.