樟樹葉多酚超聲波法提取工藝的響應面優(yōu)化

周海旭，李忠海，鐘海雁，張 慧，李文清

（中南林業(yè)科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004）

近年來，有關研究結果表明，多酚類物質具有抗氧化、抗脂質氧化、抗菌、抗病毒、預防心血管疾病、防癌、抗輻射等生物活性[1-5]，還具有滅菌或防治病蟲害的功效，因此可用以生產抑菌劑或防腐劑而被用于食品加工和運輸等行業(yè)中[6]。樟樹作為常見的經濟林樹種，其葉子中含有豐富的多酚類物質，通常將樟樹葉中的多酚類物質稱為樟樹多酚[7]。

超聲波可以破壞細胞的細胞壁，改善目標產物的選擇性，增加提取率，在天然產物提取中顯示出了明顯的優(yōu)勢[8]，超聲波提取法具有能縮短提取時間、提高有效成分得率且保護熱敏性成分等優(yōu)點，現在越來越多地被應用于植物有效成分的提取[9]。為了研究以超聲波法提取樟樹多酚的最優(yōu)工藝條件，筆者用Folin-ciocalteus法測定樟樹多酚，該法靈敏度較高，簡便易行[10]，并以乙醇為提取劑，采用響應面分析[11]方法，就提取時間、料液比和乙醇濃度對樟樹多酚提取量的影響問題進行了試驗，建立了超聲波提取樟樹多酚的數學模型，從而獲得了樟樹多酚超聲波提取的最優(yōu)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用的樟樹葉于2011年5月采自中南林業(yè)科技大學，將新鮮樹葉曬干后粉碎以備用。

1.2 主要儀器

電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；JY92-11超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；紫外分光光度儀，島津公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

準確稱取焦性沒食子酸1 g，溶解并定容于100 mL的容量瓶中以備用。分別量取4、8、12、16、20 mL的標準液加入到100 mL的容量瓶中，再分別加入60 mL的蒸餾水，充分混合3 min；再分別加入酚試劑5 mL和20 %無水碳酸鈉15 mL，充分混合1 min后定容。于70 ℃水浴，保持時間為10 min，冷卻至室溫后，在波長為760 nm的條件下測定吸光度[12]。根據不同濃度的標準液及吸光度繪制如圖1的標準曲線。測定的標準曲線回歸方程為：上式中：x為標準液的濃度（mg/L），y為吸光度。

圖1 測定多酚含量的標準曲線Fig.1 Standard curve of polyphenols content

1.3.2 單因素試驗

通過單因素試驗分別考察超聲提取時間、料液比、乙醇濃度這3個因素對樟樹多酚濃度的影響情況，確定各個試驗因素的最優(yōu)水平，從而為響應面分析試驗提供參考依據。

1.3.3 響應面分析

采用Design-Expert 8.0.7軟件中的中心組合試驗設計原理進行響應面試驗設計。根據單因素試驗結果，確定乙醇濃度、提取溫度和液料比3個因素，以樟樹葉多酚含量為響應值。試驗因素及水平見表1。

表1 樟樹葉多酚提取的響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment of polyphenols extraction in Cinnamanum camphoral

1.4 數據計算公式

樟樹多酚的提取量 (mg)＝提取液的體積×樟樹葉多酚濃度×100×10-3×2；

上列兩式中：提取液的體積單位為mL，多酚的濃度單位為mg/L。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 超聲提取時間對提取的樟樹多酚濃度的影響

超聲提取時間對提取的樟樹多酚濃度的影響情況如圖2所示。從圖2中可以看出，當超聲波提取時間為25 min左右時，提取液中的多酚濃度最大；而當提取時間繼續(xù)延長時，提取液中的多酚濃度卻隨之下降。這可能因為隨著時間的延長多酚物質被氧化，或者發(fā)生其他的化學反應而使得多酚濃度下降。

圖2 提取時間對樟樹多酚提取濃度的影響Fig.2 Effect of extraction time on concentration of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

2.1.2 料液比對提取的樟樹多酚濃度的影響

料液比對提取的樟樹多酚濃度的影響情況如圖3所示。從圖3中可以看出，提取的樟樹多酚濃度隨著料液比的增加而增加，當料液比為1∶30左右時，提取液中的多酚濃度最大，之后隨著料液比的增加提取濃度卻稍微減小。考慮到成本與所提取的樟樹多酚濃度，故選用1∶30的料液比。

圖3 料液比對樟樹多酚提取濃度的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on concentration of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

2.1.3 乙醇濃度對提取的樟樹多酚濃度的影響

乙醇濃度對提取的樟樹多酚濃度的影響情況如圖4所示。從圖4中可以看出，隨著乙醇濃度的增加，樟樹多酚的提取濃度也隨之增加。當乙醇濃度為60%時，多酚濃度達到最大值；但之后隨著乙醇濃度的增加，樟樹多酚的提取濃度反而趨于平緩。其原因可能是，隨著乙醇濃度的增加，多酚類物質在乙醇溶液中的溶解度增加，當乙醇濃度達到60%以后，溶液極性增加，導致多酚類物質的溶解度下降[13]，所以選擇濃度為60%的乙醇作為提取溶劑。

圖4 乙醇濃度對樟樹多酚提取濃度的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on concentration of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

2.2 樟樹葉多酚提取響應面法優(yōu)化分析

2.2.1 超聲波提取樟樹多酚的模型建立

響應面試驗共設有17組試驗，其中有12個分析點、5個中心點試驗。采用響應面分析法分析試驗結果，得到了如下的以多酚含量為響應值的數學模型：

式中：Y表示樟樹多酚提取量的預測值，A、B、C分別表示提取時間、乙醇濃度、料液比的數值。

采回歸方程中各變率對響應值影響的顯著性，由F檢驗來判定，“Prob＞F”值小于0.05級表示該指標顯著。模型回歸方程方差分析結果如表2所示。由表2可知，模型P值＜0.01，表明該二次方程的模型極為顯著[14]，可利用該模型來預測分析以超聲波提取的樟樹多酚的含量。提取時間（A）對樟樹多酚含量的影響是極顯著的，乙醇濃度（B）、料液比（C）對樟樹多酚含量的影響也具有顯著性，A和B的交叉因素、A和C的交叉因素對樟樹多酚含量的影響也具有顯著性。借助數據分析軟件對數學模型進行優(yōu)化，最終得出的樟樹多酚超聲波提取的最優(yōu)工藝條件為：超聲提取時間25 min、乙醇濃度60%、料液比1∶40。在此工藝條件下獲得的多酚含量為40.794 mg/g。

表2 樟樹多酚含量的ANOVA分析結果Table 2 ANOVA analysis of content of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

2.2.2 超聲波提取樟樹多酚各影響因素的交互作用

響應面圖形是響應值對試驗因子A、B、C所構成的三維空間曲面圖，從響應面分析圖中可以看出最佳參數及各參數之間的相互作用情況。根據回歸方程作出不同試驗因素的響應面分析圖（見圖5～7）[15]，圖5～7可以直觀地反映出兩個變量交互作用影響的顯著程度。因為極值條件出現在等高線的圓心處，從圖5～7中可以看出，B與C的等高線圖最圓，說明乙醇濃度和料液比之間的交互作用對樟樹多酚含量的影響最小；而等高線圖越扁平，則表示試驗因素之間交互作用的影響越大[16]。

提取時間（A）與乙醇濃度（B）對樟樹多酚交互作用的響應面圖見圖5。由圖5可知，隨著提取時間的增加樟樹多酚的含量呈逐漸增加的變化趨勢，所以提取時間可選擇25 min。當提取時間固定為25 min時，樟樹多酚的含量隨著乙醇濃度的增加呈現出先增加后減少的變化趨勢；當乙醇濃度為60%左右時，樟樹多酚的含量達到本試驗的最大值。這一試驗結果表明，乙醇濃度與提取時間二者的交互作用對樟樹多酚的含量的影響較大。

提取時間和料液比對樟樹多酚交互作用的響應面圖見圖6。由圖6可知，隨著提取時間和料液比的增加樟樹多酚含量也逐步增加。因此，料液比應選擇1∶40，超聲提取時間和料液比二者的交互作用對樟樹多酚含量的影響較大。

圖5 提取時間（A）與乙醇濃度（B）對樟樹多酚含量交互作用的響應面圖Fig.5 Response surface plot of interaction of extraction time (A) and ethanol concentration (B) on content of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

圖6 提取時間和料液比對樟樹多酚含量交互作用的響應面圖Fig.6 Response surface plot of interaction of extraction time and solid-liquid ratio on content of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

乙醇濃度和料液比對樟樹多酚交互作用的響應面圖見圖7，由圖7可知，樟樹多酚的提取量隨著乙醇濃度和料液比的增加呈現出先增加后減小的變化趨勢，乙醇濃度和料液比二者的交互作用對樟樹多酚含量的影響較小。

3 結 論

本試驗采用響應面法[17]分析了乙醇濃度、提取時間和料液比對樟樹多酚超聲波提取效率的影響情況，最終確定的樟樹多酚超聲波提取的最優(yōu)工藝條件為：提取時間25 min，料液比1:40，乙醇濃度60%。在此工藝條件下，樟樹多酚的含量為40.794 mg/g。

圖7 乙醇濃度與料液比對樟樹多酚含量的交互作用響應面圖Fig.7 Response surface plot of interaction of ethanol concentration and solid-liquid ratio on content of extracted polyphenols in Cinnamanum camphoral

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