脫脂米糠中清蛋白和球蛋白的提取工藝及氨基酸組成分析

王艷玲，張 敏

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.北京工商大學食品學院，北京 100037）

穩定化米糠提取米糠油之后，副產品脫脂米糠中還含有20%左右的蛋白質，可用來進一步開發米糠蛋白產品。與傳統生產植物蛋白的大豆粕、花生粕相比，米糠中蛋白質的含量偏低，但作為世界第一大作物的加工副產品，僅在我國，米糠的年產量就達到了1000萬t，因此米糠中蛋白質的數量是不容忽視的[1]。米糠蛋白含有的必需氨基酸完全，氨基酸組成更接近FAO/WHO的推薦模式；賴氨酸含量比大米胚乳、小麥面粉以及其他谷物中的都要高，生物效價（PER為2.0～2.5）與牛奶中的酪蛋白相近（PER為2.5），消化率達90%以上，是一種營養價值很高的植物蛋白。米糠蛋白還有一個最大的優點：低過敏性，它是已知谷物中過敏性最低的，可用于嬰幼兒食品中[2]。米糠蛋白質組成，根據Osborne提出的以溶解特性來劃分，可分為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，這四種蛋白質的比例大致為37∶36∶22∶5，由此可見，米糠中清蛋白和球蛋白含量較高，其中清蛋白和球蛋白是由單鏈組成的低分子量蛋白質，它為代謝活性蛋白質，含有很多生理活性蛋白質，在稻谷發芽早期可迅速啟動進行生理作用[3]。盡管人們早就認識到米糠的營養和藥用價值，但到目前為止，人們尚未很有效利用米糠蛋白。由于米糠中蛋白質是一個復合的體系，含有清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶谷蛋白，是一個組成復雜的混合物；米糠蛋白的溶解性較差，極易發生沉淀，這主要是由于蛋白分子間存在很強的二硫鍵相互作用；米糠中的植酸和纖維素含量較高，這兩種物質與蛋白質緊密結合，使得蛋白質不易分散出來[4]。國內外已對小麥蛋白組分、大豆蛋白和玉米醇溶蛋白等進行了大量的研究和應用，張春紅和周小婷[5]采用Osborne法對麥胚蛋白進行分級，得到麥胚清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4種組分；管驍和姚惠源[6]也按照Osborne蛋白分級提取方法對燕麥麩蛋白進行了精細的分類，分別得到了燕麥麩清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。而目前對米糠蛋白組分研究的較少，本實驗參照Osborne方法對米糠中蛋白組分進行分級提取，依次利用蒸餾水和NaCl溶液來提取米糠中清蛋白和球蛋白，確定兩種米糠蛋白產品的最佳提取工藝并對兩種產品的氨基酸組成進行測定，以期對今后米糠產品的深度開發和利用提供科學的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂米糠 黑龍江省北大荒米業有限公司提供（原料組成為：水分7.1%、蛋白質19.1%、脂肪2.8%、纖維素23.1%、淀粉16.0%）；米糠蛋白 以脫脂米糠為原料采用堿溶酸沉法實驗室自制的蛋白產品；牛血清白蛋白 美國Sigma公司；其他試劑 均為國產分析純。

722型可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；pH-3c型pH計 上海偉業儀器廠；SC-3614型低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；日立L8800型氨基酸自動分析儀 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠清蛋白和球蛋白的提取工藝[7]圖1為米糠清蛋白和球蛋白的提取工藝流程。取20g脫脂米糠，加一定料液比的蒸餾水浸提，在一定溫度下攪拌一段時間后，4000r/min離心20min得上清液和殘渣，其中上清液經酸堿調至清蛋白等電點4.1，4000r/min離心20min，將沉淀透析后冷凍干燥得米糠清蛋白粉；殘渣繼續用一定濃度的NaCl按一定的料液比在一定溫度下提取一段時間，再經4000r/min離心20min得上清液，將上清液調至球蛋白等電點4.3，4000r/min離心20min，將沉淀透析后冷凍干燥得米糠球蛋白粉。

1.2.2 蛋白得率的測定方法[8]提取液中蛋白質含量測定用福林酚法[9]測得。

蛋白得率（%）=提取液中蛋白質量/米糠質量×100

1.2.3 脫脂米糠清蛋白的提取工藝研究[10-11]本實驗分別以料液比、提取時間、提取溫度為影響因子，對米糠清蛋白提取工藝進行單因素實驗。

分別按照1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的料液比加入蒸餾水，于50℃恒溫水浴鍋中提取2.5h，離心取上清液測定體積和蛋白含量，計算獲得蛋白得率。

以料液比1∶10加入蒸餾水，在50℃恒溫水浴鍋中分別提取1.5、2、2.5、3、3.5、4h，離心取上清液測得蛋白得率。

以料液比1∶10加入蒸餾水，分別在25、30、35、40、45、50、55℃下提取2.5h，離心取上清液測得蛋白得率。

通過單因素實驗結果，選取工藝參數范圍，以米糠蛋白得率為指標，按L9（34）表設計正交實驗，選取的因素水平見表1。

1.2.4 米糠球蛋白的提取工藝研究 以蛋白得率為研究指標，以料液比、提取時間、提取溫度、NaCl濃度為影響因素，對米糠清蛋白提取工藝進行單因素實驗。

稱取5份殘渣，用2%的NaCl溶液溶解，料液比分別在1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的條件下，于45℃提取2h。離心后測定上清液的體積和蛋白含量，計算獲得的蛋白得率。

用2%的NaCl料液比為1∶10溶液溶解，分別在45℃提取1.5、2、2.5、3、3.5、4h時，離心測定上清液的蛋白得率。

用2%的NaCl料液比為1∶10溶液溶解，分別在溫度為35、40、45、50、55℃時，提取2h后，離心測定上清液的蛋白得率。

NaCl溶液的濃度分別在1%、2%、3%、4%、5%、6%時，料液比為1∶10，45℃提取2h。離心測定上清液的蛋白得率。

通過單因素實驗結果，選取工藝參數范圍，以米糠蛋白得率為指標，按L9（34）表設計正交實驗，選取的因素水平如表2所示。

1.2.5 氨基酸組成分析[12]準確稱取樣品20mg加入8mL的6mol/L HCl沖入氮氣封口，在110℃烘箱內水解22h，冷卻搖勻過濾，雙蒸水定容至50mL，潤洗3次以上，取1mL凍干至干燥，凍干后加入1mL 0.02mol/L HCl搖勻，14000r/min離心15min，吸取上清液0.8mL過0.45μm濾膜，上日立L8800型氨基酸自動分析儀。

2 結果與分析

2.1 清蛋白提取工藝的單因素實驗

2.1.1 料液比對米糠清蛋白得率的影響 提取米糠清蛋白的料液比與清蛋白得率的關系曲線如圖2所示。

由圖2測定結果可以看出，當料液比在1∶12之前，米糠清蛋白得率隨料液比的增加而增大，料液比繼續增加，提取率的提高不明顯。由于米糠中含有一定量的膳食纖維和淀粉，具有較強的吸水膨脹能力，料液比過低時物料變得黏稠，流動性差，不易攪拌，蛋白不易溶出；清蛋白是水溶性蛋白，提高料液比可以提高蛋白質的提取率[13]。但過高的料液比會降低提取液的蛋白濃度，增加生產成本。

2.1.2 提取時間對米糠清蛋白得率的影響 提取米糠清蛋白的時間與清蛋白得率的關系曲線如圖3所示。

由圖3可以看出，米糠清蛋白的得率在2h前隨著提取時間的增加蛋白得率明顯增加，3h后提取率增加變緩甚至出現輕微降低的趨勢。分析原因可能在于，隨著提取時間的延長，清蛋白大部分溶解于水中，提取率增加；3h后繼續延長提取時間，蛋白得率出現下降，這與陳季旺[14]的提取率隨時間延長而增大的結論不同，應該與提取溫度有關。文獻采用在室溫條件下提取，蛋白溶出較慢，需要長時間。溫度的升高可加速蛋白溶出，在本文50℃的提取條件下，隨時間延長可能使蛋白發生了少部分水解或聚合反應，從而使提取液中蛋白質的含量略微降低[15]。

2.1.3 提取溫度對米糠清蛋白得率的影響 提取米糠清蛋白的溫度與清蛋白得率的關系曲線如圖4所示。

由圖4可以看出，隨著溫度的升高，米糠清蛋白得率不斷增加，45℃時蛋白得率達到最大，當溫度超過45℃時蛋白得率開始下降。可能的原因是蛋白發生水解引起。有報道[16]稱，米糠開始糊化溫度為60～75℃，淀粉的糊化使原來的懸浮液變成了粘性很強的淀粉糊，阻礙了蛋白質的溶出，從而降低了蛋白質的得率。本研究獲得的提取清蛋白和球蛋白的提取溫度與其他文獻[14]報道不同，可能與原料來源、顆粒狀態以及提取蛋白種類等不同有關。

2.2 清蛋白提取的正交實驗

以蛋白得率作為評價指標，清蛋白的正交實驗結果如表3和表4所示。

對表3的正交實驗結果進行極差分析可知，影響脫脂米糠中清蛋白得率因素的主次順序為A＞B＞C，即料液比對清蛋白得率的影響最大，提取時間次之，提取溫度的影響最小。最佳工藝參數組合為A3B3C2，即正交實驗表中的第9組實驗，在料液比為1∶14，提取時間為3h，溫度為45℃條件下，可獲得最高提取率（14.64%）的米糠清蛋白產品。

表4的方差分析結果表明，料液比對米糠清蛋白提取得率影響顯著（F比＞F臨界值），而其他因素對米糠清蛋白提取得率影響不顯著，即料液比為清蛋白提取的關鍵因素。

2.3 提取球蛋白的單因素實驗

2.3.1 料液比對米糠球蛋白得率的影響 提取米糠球蛋白的料液比對球蛋白得率的關系曲線如圖5所示。由圖5可以看出，提取米糠球蛋白的料液比在小于1∶10時，隨料液比增大米糠球蛋白得率增大；料液比大于1∶10后，繼續增加料液比，米糠球蛋白的蛋白得率出現降低。這與蛋白質的分解及提取液使球蛋白濃度降低有關。與清蛋白相比，球蛋白的最佳料液比相對減少了很多，分析原因可能是由于經過清蛋白提取后，原料已吸收一部分水分，再提取球蛋白時，所需料液比明顯降低。

2.3.2 提取時間對米糠球蛋白得率的影響 提取米糠球蛋白的反應時間與球蛋白得率的關系曲線如圖6所示。

由圖6可知，球蛋白得率在2h之前隨時間延長而增加，在2h處達到最大值；在2h之后隨時間延長蛋白得率出現降低趨勢，分析原因可能是隨提取時間延長蛋白發生了部分水解和聚合反應，使蛋白質的提取率降低。

2.3.3 提取溫度對米糠球蛋白得率的影響 提取米糠球蛋白的反應溫度與球蛋白得率的關系曲線如圖7所示。

由圖7可知，提取溫度在50℃之前，球蛋白得率隨提取溫度的升高逐漸增大，在50℃時球蛋白得率達到最大值，在50℃之后隨溫度的繼續升高，球蛋白得率緩慢下降。與清蛋白相比，球蛋白的提取溫度較高，這與球蛋白的水溶性差有關。

2.3.4 NaCl濃度對米糠球蛋白得率的影響 提取米糠球蛋白的反應NaCl濃度與球蛋白得率的關系曲線如圖8所示。

由圖8可以看出，在NaCl濃度為3%時蛋白得率達到最大值，之后呈下降趨勢。可見高濃度的鹽并不能增大得率，這與朱科學[17]提取小麥胚芽球蛋白時，使用的NaCl濃度相一致。實驗中發現，鹽濃度越高，混合液粘度越大，實驗操作越不易進行。

2.4 球蛋白正交實驗

以球蛋白得率作為評價指標，球蛋白的正交實驗結果如表5和表6所示。

對表5的正交實驗結果進行極差分析可知，影響脫脂米糠中球蛋白得率因素的主次順序為D＞A＞C＞B，即NaCl濃度對球蛋白得率的影響最大，料液比次之，提取時間的影響最小。最佳工藝參數組合為A1B1C2D2，即料液比為1∶10、提取時間為2h、溫度為50℃，NaCl濃度為3%。

表6方差分析結果表明，NaCl濃度、料液比對米糠球蛋白提取得率影響顯著（F比＞F臨界值），而其他因素對米糠清蛋白提取得率影響不顯著，即NaCl濃度、料液比為球蛋白提取的關鍵因素。

在較優參數組合條件下進行三次驗證實驗，脫脂米糠提取球蛋白的蛋白得率為4.25%、4.31%、4、29%，平均蛋白得率為4.28%，高于正交表中所有組合的實驗結果，證明了正交實驗的可靠性。

2.5 氨基酸組成分析

表7是測定的米糠蛋白、米糠清蛋白和米糠球蛋白的氨基酸組成數據結果。

米糠蛋白是一個包含清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的蛋白混合物體系，清蛋白和球蛋白則是具有不同天然構象的混合物。從表7可以看出，米糠蛋白和清蛋白、球蛋白氨基酸含量有所不同。米糠蛋白的各種氨基酸含量大多都低于清蛋白和球蛋白，只有丙氨酸含量明顯高于二者，甘氨酸含量大于米糠清蛋白而小于米糠球蛋白，賴氨酸和蘇氨酸含量低于米糠清蛋白高于米糠球蛋白；這三種米糠的蛋白產品中，丙氨酸和甘氨酸的含量均高于其他氨基酸。在米糠蛋白的氨基酸組成中含有半胱氨酸，而在其他二種蛋白中沒有檢測出半胱氨酸。半胱氨酸是一種具有生理功能的氨基酸，是組成蛋白質的20多種氨基酸中惟一具有還原性基團巰基（-SH）的氨基酸。從親水性氨基酸和疏水性氨基酸的含量來看，這三種蛋白產品的親水性氨基酸含量相差較大，疏水性氨基酸的含量相差不多，且親水性氨基酸的含量遠高于疏水性氨基酸的含量。有研究表明[18]，可以根據蛋白產品的氨基酸含量來判斷其功能性質。有關米糠蛋白產品功能性質有待進一步深入的研究。

從實驗結果可以看出，米糠蛋白和清蛋白、球蛋白中均含有人體必需的七種氨基酸（因酸水解破壞了色氨酸導致測不出），其組成均接近FAO/WHO模式，并且苯丙氨酸+酪氨酸含量遠高于FAO/WHO模式推薦值。組氨酸雖不是人體必需氨基酸，但對于嬰兒而言卻是必需氨基酸，米糠清蛋白中組氨酸的含量相對較高。

3 結論

本實驗對米糠中清蛋白和球蛋白提取工藝進行研究，結果表明，料液比對脫脂米糠中清蛋白得率影響顯著，而提取時間、提取溫度影響不顯著。清蛋白提取最佳工藝為：料液比1∶14、提取時間3h、溫度45℃，清蛋白得率為14.64%。NaCl濃度和料液比對米糠球蛋白的提取得率影響顯著，球蛋白提取的最佳工藝為料液比1∶10、提取時間2h、溫度50℃、NaCl濃度3%，球蛋白得率為4.28%。

米糠蛋白和清蛋白、球蛋白進行的氨基酸分析表明，米糠蛋白產品中氨基酸組成平衡，富含功能性氨基酸，氨基酸的含量接近FAO/WHO推薦模式，是較好的植物蛋白質來源。

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