二次回歸正交旋轉組合優化羅非魚下腳料酶解液螯合鋅的工藝條件

李同剛，洪鵬志，楊 萍，趙 陽

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

羅非魚是當前淡水養殖業的重要養殖品種之一。我國是世界上最大的羅非魚養殖國及出口國，2009年產量已達120萬t，約占當年世界總產量的一半。羅非魚凍魚片加工過程中會產生總質量40%以上的下腳料[1-3]。羅非魚下腳料蛋白酶解液含有豐富的氨基酸、小肽、微量元素等多種小分子營養成分，具有生物利用率高等優點。鋅是人體必需微量元素，參與體內200多種酶的組成，是細胞內最豐富的微量元素。根據報道，鋅是中國人缺乏的營養素之一，尤其是兒童、青少年缺鋅比較嚴重，嚴重的已經影響智力和身高的正常發育。目前關于酶解物螯合金屬元素的研究很多，如趙洪雷等[4]制備了低質魚小肽螯合鋅；楊珊珊等[5]研究了羅非魚皮多肽制備鋅螯合鹽；鐘明杰[6]用帶魚下腳料蛋白水解原料得到了鈣、鐵螯合物；汪學榮[7]使用豬血多肽制備鐵螯合鹽等。本實驗利用復合酶酶解羅非魚下腳料，對酶解液與鋅的螯合工藝進行優化，探討螯合的最佳工藝條件，旨在為羅非魚下腳料的綜合加工利用提供新途徑，并希望為人體補鋅提供安全、綠色原料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚下腳料 由廣東恒興水產公司提供，羅非魚下腳料（包括頭、魚骨排、內臟）去內臟，洗凈，于絞肉機中絞碎后-18℃凍藏備用；中性蛋白酶（2.0×105U/g）、風味蛋白酶（1.5×104U/g）均購于南寧龐博生物工程有限公司；EDTA、硫酸鋅 均為分析純，購于廣州化學試劑廠；二甲基橙 分析純，廣東光華化學廠有限公司。

PHS-3C酸度計 上海精密科學儀器有限公司；Mini pellicon超濾機 美國Thermo公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機 日本日立公司；EMS-4B磁力攪拌器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；N-1100旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解液的制備 取羅非魚下腳料一定量置于燒杯中，按固液比1∶4加水，于55℃的恒溫水浴鍋中預熱，按總加酶量1500U/g、中性蛋白酶與風味蛋白酶復合比1∶2加酶，pH不調，酶解30min。然后沸水滅酶15min，4500r/min離心15min得到上清液。將上清液通過0.45μm膜微濾，再過10ku超濾膜得到小于10ku的酶解液。

1.2.2 α-氨基態氮的測定 甲醛滴定法[8]。

1.2.3 螯合工藝

1.2.3.1 配位比對螯合率的影響 酶解液與硫酸鋅在配位比（α-氨基態氮與鋅離子的摩爾比[9]）設為1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1。

1.2.3.2 溫度對螯合率的影響 螯合溫度設為40、50、60、70、80℃。

1.2.3.3 時間對螯合率的影響 時間設為10、15、20、25、30min。

1.2.3.4 pH對螯合率的影響 螯合pH設為5、6、7、8、9。

在單因素實驗基礎上，進行二次回歸正交旋轉組合設計。螯合工藝流程：酶解液→測α-氨基態氮→按比例加Zn2+→攪拌→振蕩合成→離心分離→真空濃縮→乙醇洗滌→測螯合率。

1.2.4 螯合率的測定 EDTA絡合滴定法[10]。

式中：C-EDTA標準溶液的濃度，mol/L；V1-滴定螯合態微量元素所消耗的EDTA溶液體積，mL；V0-滴定微量元素的總量所消耗的EDTA溶液體積，mL。

1.2.5 二次回歸正交旋轉組合設計 依據單因素實驗的結果，確定因素編碼水平范圍，采用二次回歸正交旋轉組合設計，以螯合率為指標，取配位比、溫度、時間、pH作為考察因素，共進行31次實驗，因素編碼見表1。

1.2.6 實驗結果處理 本實驗均做了三次平行，結果為三次實驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 酶解液與硫酸鋅螯合的單因素實驗

2.1.1 配位比對螯合率的影響 配位比是影響螯合率的一個重要因素，因為配位比過小不能形成穩定的環狀結構[5]，導致螯合率較低；反之過大，螯合物雖穩定但是螯合率也在下降，造成原料的浪費，經濟上也不合理。由圖1可知，在溫度60℃，時間15min，pH6.5時，配位比對螯合率的影響呈波動變化，配位比在2.5∶1時螯合率達到最大值。

2.1.2 溫度對螯合率的影響 由圖2可知，在配位比2.5∶1，時間15min，pH6.5條件下，隨著溫度的升高螯合率也升高，當溫度在60～70℃時螯合率最高，再升高溫度螯合率下降。這是由于螯合反應為吸熱反應[11]，溫度高有利于螯合反應，但溫度過高酶解液里的肽及其螯合物的結構易被破壞；溫度過低，反應速率慢，螯合率不高。

2.1.3 時間對螯合率的影響 由圖3可知，在配位比2.5∶1，溫度60℃，pH6.5條件下，時間在15min時螯合效果最佳，10min時螯合反應不完全，所以螯合率不高；15min之后隨著超濾酶解液中肽或氨基酸濃度的降低，螯合率也在下降。

2.1.4 pH對螯合率的影響 由圖4可知，在配位比2.5∶1，溫度60℃，時間15min條件下，pH對螯合率影響很大，隨著pH升高螯合率先升后降，pH=7時效果最佳，當pH在5、6時螯合率緩慢上升，當pH＞7以后螯合率下降很快。原因可能是當溶液中H+大量存在時，H+會與鋅離子爭奪供電子基團，不利于螯合物的生成；另外，在堿性條件下，羥基爭奪鋅離子而優先生成氫氧化鋅沉淀而影響螯合物的形成[12]。

2.2 二次回歸正交旋轉組合優化酶解液與硫酸鋅的最佳螯合條件

2.2.1 經驗數學模型 在單因素實驗的基礎上，根據表1因素水平編碼表進行二次回歸正交旋轉組合實驗，實驗設計及結果見表2。

將實驗結果經Design Expert軟件處理，得到回歸方程：Y=87.59286+1.09375X1+0.72125X2+0.47375X3-0.87625X4+0.30437X1X3+1.06938X2X3+1.30563X2X4-1.39228-2.17853-1.81603-1.717282。

2.2.2 二次回歸模型的顯著性檢驗 二次正交旋轉組合設計實驗結果方差分析如表3所示。

為檢驗回歸方程的有效性，按F1=失擬均方/誤差均方，F2=回歸均方/剩余均方的程序進行檢驗。由表3可知，在0.01水平上失擬項F1不顯著、F2極顯著，這表明方程與實驗數據的配合是可行的，可以用來建立模型。

根據表3，剔除α=0.10顯著水平不顯著項后，簡化后的回歸方程為：Y=87.59286+1.09375X1+0.72125X2+0.47375X3-0.87625X4+1.06938X2X3+1.30563X2X4-1.39228-2.17853-1.81603-1.71728。

該模型的R2=0.95588，R2adj=0.91727，說明回歸方程對實際實驗擬合情況較好。

2.2.3 模型驗證 為驗證模型的適用性，選取4組結果進行驗證。結果見表4。

由表4可知，4組的螯合率測定結果與根據模型計算得到的結果誤差均小于5%，說明該模型能較好地反映螯合過程螯合率的變化情況。

2.2.4 各因素的重要性分析 在表3里，因為X1、X2、X3、X4的均方分別為28.71094、12.48484、5.38654、18.42754，所以影響螯合率的四因素主次順序為：配位比＞pH＞溫度＞時間。

2.2.5 最佳螯合條件的確定 采用Design Expert軟件分析實驗數據，得到螯合的最佳條件為：配位比0.39水平（2.70∶1），溫度0.25水平（71.25℃），時間0.22水平（15.44min），pH為-0.29水平（6.86），理想螯合率可達88.08%。考慮到實驗室允許的條件以及實際應用過程中的必要性和可操作性，對優化的工藝參數進行了合理選擇，即配位比2.70∶1、溫度71.3℃、時間15min、pH6.86，驗證實驗結果表明，此時螯合率可達87.56%，與理論值相差1%之內。在相關研究中，低質魚蛋白多肽在理想條件下與鐵的螯合率為94.15%[5]；帶魚下腳料蛋白水解液在最佳條件下與鈣螯合，螯合率達79.75%[6]，大部分植物蛋白螯合率不高。相比之下，本實驗得到的螯合條件較合理。

3 結論

本實驗在單因素實驗結果的基礎上，運用二次回歸正交旋轉組合設計的方法，確定了羅非魚下腳料酶解液螯合鋅的最佳螯合工藝條件為：配位比2.70∶1、溫度71.3℃、時間15min、pH6.86，螯合率達到87.56%，其中，各個因素對螯合率影響大小的順序是：配位比＞pH＞溫度＞時間。

[1]楊萍.羅非魚下腳料蛋白酶解液制備蔬菜泥罐頭的研究[J].食品科技，2008（5）：89-91.

[2]趙梅.羅非魚下腳料酶解工藝的響應面法優化[J].食品研究與開發，2007（5）：48-52.

[3]吳燕燕，李來好.酶法由羅非魚加工廢棄物制取調味料的研究[J].南方水產，2006，2（1）：49-53.

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[5]楊珊珊.羅非魚皮多肽鋅螯合鹽的制備及性質研究[D].南昌：南昌大學，2008.

[6]鐘明杰.帶魚下腳料蛋白水解螯合物制備及生物特性研究[D].青島：中國海洋大學，2009.

[7]汪學榮.豬血多肽鐵螯合鹽的制備技術及性質研究[D].重慶：西南大學，2008.

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