糙米發(fā)芽浸泡過程中臭氧對(duì)微生物滅菌效果的影響

馬 濤，陳偉玲

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866；2.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013）

發(fā)芽糙米不僅改善了糙米口感，而且使促進(jìn)人體健康和提高人體免疫力的成分，如γ-氨基丁酸、谷胱甘肽、谷維素和阿魏酸等超出精白米數(shù)倍[1]。發(fā)芽糙米雖富含營(yíng)養(yǎng)，但由于原料本身帶菌狀況復(fù)雜，且在發(fā)芽過程中受發(fā)芽環(huán)境條件影響，發(fā)芽過程中極易受到微生物污染。目前常用的方法是在發(fā)芽過程中添加次氯酸鈉等殺菌劑，這不僅增加了現(xiàn)場(chǎng)操作的困難，而且容易造成環(huán)境污染，增加污水排放和設(shè)備維護(hù)費(fèi)用，更容易產(chǎn)生藥劑殘留而帶來產(chǎn)品的安全隱患。因此，探索一種既能有效殺滅或控制發(fā)芽過程中微生物，又便于操作且對(duì)環(huán)境影響小，提高產(chǎn)品安全性的技術(shù)和方法則成為發(fā)芽糙米生產(chǎn)的關(guān)鍵。臭氧殺菌技術(shù)就是近年來發(fā)展起來的一種非熱殺菌技術(shù)，具有殺菌能力強(qiáng)、速度快、范圍廣、安全性好、操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)成本低等突出特點(diǎn)，已經(jīng)成為食品安全技術(shù)中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)[2-3]。本實(shí)驗(yàn)以糙米的浸泡溫度、臭氧濃度、臭氧作用時(shí)間、滅菌率為指標(biāo)，研究臭氧對(duì)糙米發(fā)芽浸泡過程中滅菌效果的影響，為糙米發(fā)芽過程中微生物污染的控制，消除發(fā)芽糙米食品安全隱患奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糙米 遼星1號(hào)，中稻股份有限公司；pH=9.0的硼酸緩沖液（6g/100mL）、重蒸苯酚溶、60%乙醇溶液、10%次氯酸鈉 濟(jì)南鴻鑫化工有限公司；GABA分析純 SIGMA公司。

SK-CFG-10C臭氧發(fā)生器 濟(jì)南三康環(huán)保科技有限公司；GDYS-101SC臭氧測(cè)定儀 長(zhǎng)春吉大小天鵝儀器有限公司；AS1菌落記數(shù)儀 杭州迅數(shù)科技有限公司；YXQ-LS-75S11立式全自動(dòng)壓力滅菌鍋 北京科創(chuàng)百方科技發(fā)展有限公司；SW-CJ-1F10超凈工作臺(tái) 蘇州蘇杰凈化設(shè)備公司；1245電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH.B11-500電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HH-601A超級(jí)恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糙米浸泡 稱取糙米5g，用1∶4的無(wú)菌水浸泡[4]，然后分別放到24、27、30、33、36℃恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)9h。

1.2.2 臭氧處理 打開臭氧發(fā)生器，運(yùn)行20min，使臭氧發(fā)生器導(dǎo)氣管口的臭氧氣體濃度穩(wěn)定維持在5.0mg/L[5]，在無(wú)菌的條件下，把浸泡糙米的小燒杯放在臭氧導(dǎo)氣管口下分別處理1、2、3、4、5min。

1.2.3 微生物計(jì)數(shù) 臭氧處理后采用傾注平板計(jì)數(shù)法對(duì)微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后再設(shè)定不同的臭氧濃度：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0mg/L，處理方法同1.2.2，每次實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.2.4 滅菌率計(jì)算 臭氧的滅菌效果依據(jù)微生物的滅菌率來評(píng)價(jià)，滅菌率的計(jì)算公式如下：

式中：N0：原始菌落數(shù)；N：處理后的菌落數(shù)；N’：空白菌落數(shù)。

1.2.5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以浸泡溫度、臭氧濃度、臭氧作用時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以真菌總數(shù)的滅菌率為響應(yīng)值，每個(gè)因素取三個(gè)水平（-1、0、1），設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面因素水平編碼表如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸泡溫度對(duì)滅菌率的影響 臭氧濃度為5.0mg/L，臭氧作用時(shí)間為3min條件下，浸泡溫度對(duì)微生物滅菌效果的影響見圖1。

由圖1（a）和圖1（b）可以看出，隨著浸泡溫度的升高，臭氧的氧化能力增強(qiáng)，滅菌率增大，當(dāng)溫度為30℃時(shí)，滅菌率最大，隨著溫度的繼續(xù)增大，滅菌率反而降低了，是因?yàn)槌粞蹼S溫度的升高，分解速度加快，因此浸泡溫度為30℃時(shí)最佳。a圖中的36℃時(shí)真菌總數(shù)下降，是因?yàn)闇囟冗^高，造成微生物蛋白質(zhì)變性死亡所導(dǎo)致。

2.1.2 臭氧濃度對(duì)滅菌率的影響 浸泡溫度為30℃，臭氧作用時(shí)間為3min，臭氧濃度對(duì)滅菌效果的影響見圖2。

圖2的（a）與（b）變化趨勢(shì)相似，隨著臭氧濃度的增大，滅菌率呈增加趨勢(shì)。在臭氧濃度為4.0～5.0mg/L階段，滅菌率較高，且滅菌率分別達(dá)到99.992%和99.973%；但濃度繼續(xù)增大，滅菌率的增大的幅度很小，分別增長(zhǎng)了0.004%和0.009%，因此臭氧濃度為5.0mg/L時(shí)滅菌效果最佳。

2.1.3 臭氧作用時(shí)間對(duì)滅菌率的影響 浸泡溫度為30℃，臭氧濃度為5.0mg/L，臭氧作用時(shí)間對(duì)糙米發(fā)芽浸泡過程中微生物滅菌效果的影響見圖3。

圖3顯示，臭氧對(duì)真菌總數(shù)和酵母菌數(shù)的滅菌趨勢(shì)相似，根據(jù)總菌數(shù)和滅菌率，可以看出在臭氧作用時(shí)間為3min時(shí)真菌滅菌率達(dá)到99.992%，酵母菌滅菌率達(dá)到99.995%，繼續(xù)增加臭氧的作用時(shí)間滅菌率分別增加0.006%和0.005%，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的各方面條件和滅菌效果來看，臭氧作用時(shí)間為3min時(shí)最佳。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化臭氧滅菌條件

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以浸泡溫度、臭氧濃度、臭氧作用時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以真菌總數(shù)的滅菌率為響應(yīng)值，每個(gè)因素取三個(gè)水平（－1、0、1），根據(jù)Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[6－11]，設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

利用Design Expert 7.0軟件，以浸泡溫度、臭氧濃度、臭氧作用時(shí)間為響應(yīng)變量，以滅菌率為響應(yīng)值對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到回歸模型方程為：

方程中B、C的系數(shù)較大，表明臭氧濃度和臭氧作用時(shí)間對(duì)滅菌率具有顯著意義。

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，回歸模型極顯著（p=0.0059＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.0629＞0.05），表明回歸方程擬合程度良好；決定系數(shù)R2=0.9586，說明因變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著。綜上所述，使用該模型可以較好的對(duì)響應(yīng)值（滅菌率）進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3中，一次項(xiàng)B、C及二次項(xiàng)B2、C2表現(xiàn)為極顯著，二次項(xiàng)BC為顯著，表明它們對(duì)響應(yīng)值的影響極大。根據(jù)表3可以得出，各影響因素的主次順序?yàn)椋築（臭氧作用時(shí)間）＞C（臭氧濃度）＞A（浸泡溫度）。

2.2.2 響應(yīng)面分析 利用Design Expert 7.0軟件對(duì)二次回歸模型進(jìn)行規(guī)范分析，浸泡溫度、臭氧作用時(shí)間、臭氧濃度之間交互作用對(duì)滅菌率的影響見圖4～圖6。

由響應(yīng)面回歸分析和回歸方程擬合，繪出響應(yīng)面分析圖，見圖4～圖6。等高線的形狀可以反映出因素之間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱[12]，由圖4～圖6的等高線的形狀可以看出，浸泡溫度與臭氧作用時(shí)間、浸泡溫度與臭氧濃度之間的交互作用不顯著，曲線較為平緩；臭氧的濃度與作用時(shí)間對(duì)滅菌率影響的交互作用顯著，曲線比較陡，這與回歸方程方差分析結(jié)果一致。由圖4可見，根據(jù)回歸分析方程在考察的區(qū)域內(nèi)繪制響應(yīng)面圖發(fā)生彎曲，說明了因素A、C對(duì)Y是非線性的，因素A、C對(duì)Y存在二次項(xiàng)。隨著浸泡溫度和臭氧作用時(shí)間的提高，Y值也在增大，當(dāng)浸泡溫度和臭氧作用時(shí)間升高到一定程度時(shí)，Y值達(dá)到最大，浸泡溫度和臭氧作用時(shí)間繼續(xù)升高時(shí)，Y值又會(huì)隨之下降，說明兩者取某個(gè)適中值時(shí)，可使Y值達(dá)到最大。同理，從圖5、圖6可以看出，A、B和B、C同樣對(duì)Y是非線性的，對(duì)Y同樣存在二次項(xiàng)。因此，可以通過軟件優(yōu)化、模擬得最佳提取條件。

2.2.3 臭氧滅菌最佳條件的確立與檢驗(yàn) 由Design軟件可求出回歸模型極值點(diǎn)，即最佳滅菌條件：得A、B、C的值為：A=30.2766，B=3.71995，C=5.3195，即浸泡溫度為30.2766℃，臭氧作用時(shí)間為3.71995min，臭氧濃度為5.3195mg/L。為檢驗(yàn)響應(yīng)面的可靠性，在最佳滅菌條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考錄到實(shí)際操作，將最佳條件修正為：浸泡溫度為30℃、臭氧作用時(shí)間為3.7min、臭氧濃度為5.3mg/L。此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，臭氧平均滅菌率為99.994%，與預(yù)測(cè)值接近，說明回歸方程能比較真實(shí)地模擬各因素對(duì)臭氧滅菌率的影響，因此，用該回歸模型優(yōu)化臭氧滅菌條件是可行的。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)臭氧在糙米發(fā)芽過程中的滅菌條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了浸泡溫度、臭氧作用時(shí)間、臭氧濃度3個(gè)因素對(duì)滅菌率的二次回歸方程模型，經(jīng)檢驗(yàn)，模型準(zhǔn)確率有效，可以用該模型分析預(yù)測(cè)各因素對(duì)臭氧滅菌率的影響。通過響應(yīng)面優(yōu)化模型確定臭氧滅菌的最佳條件為：浸泡溫度30℃、臭氧作用時(shí)間3.7min、臭氧濃度5.3mg/L，此條件下臭氧滅菌率可達(dá)到99.994%。

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