響應面法優化馬血中S O D超聲波提取工藝研究

熱孜耶·喀日，米麗班·霍家艾合買提，熱合滿·艾拉，許銘強

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052）

超氧化物歧化酶（SOD）是廣泛存在于生物體內的一類金屬酶[1]，它能催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，從而能有效清除機體內超氧陰離子自由基，是生物體重要的細胞防御系統之一[2]，有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射和消炎作用[3]。SOD主要存在于血細胞中，因此要提取SOD，必須使細胞膜破碎，通常使用的方法有：溶脹法[4]、機械破碎法、酶溶法、有機溶劑法。目前，SOD用于延緩人體衰老，防止色素沉著，并治療慢性多發性關節炎等癥，也被廣泛地應用于生產日用化工品，如SOD化妝護膚品，對抗衰老、去除臉面雀斑等有明顯的效果。隨著日用化工產品的發展及SOD在臨床上的應用，SOD的需求量越來越大[5]。我國是一個傳統養馬大國，有15個地方品種和11個培育品種，約占世界馬品種的十分之一。目前，存欄馬匹達到790萬匹，居世界之首[6]。馬血是一種寶貴的蛋白質資源，具有很高的藥用價值，但對其提取方面的系統研究還很少。目前，一般從動物血中提取SOD的工藝多為正交設計，但此方法精確度不高，且不能考慮因素之間的交互作用。響應面分析法是一種優化工藝條件的高效方法，可確定各因素及其交互作用在工藝過程中對指標（響應值）的影響，精確地反映因素與響應值之間的關系[7]。本研究從食品安全的角度考慮，以響應面方法優化超聲波提取馬血中SOD，考察超聲條件對提取SOD比活力的影響，以期對動物血資源的綜合開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬血 華菱屠宰場；檸檬酸三鈉、氯化鈉、鄰苯三酚、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白、乙醇 以上皆是分析純。

HH-54數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠；KQ-250DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TD5A-WS臺式低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；PL203電子天平 梅特勒托利儀器有限公司；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋 北京市光明醫療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅細胞的制備 取新鮮馬血與0.38%檸檬酸三鈉體積比為1∶7的溶液，攪拌均勻，以3000r/min的速度離心15min，除去血漿，收集紅細胞，用2倍體積的0.9%NaCl溶液洗滌3次，在-15℃條件下保存備用。

1.2.2 響應面法優化提取條件 為了優化超聲波提取工藝條件，選取超聲時間、超聲功率、超聲溫度做單因素實驗；在單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理，采用三因素三水平的響應面分析法進行實驗設計，確定馬血中SOD超聲波提取的最佳工藝條件，實驗因素與水平見表1。

1.2.3 蛋白質含量測定[8]考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量。

1.2.4 SOD活性測定[9]鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 超聲時間對SOD提取的影響 準確取15mL自然解凍的紅細胞置于試管中，加入以3∶1的蒸餾水，攪拌15min后，在超聲功率200W，溫度40℃條件下分別處理5、10、15、20、25min，測定蛋白質的濃度和酶的活性。重復三次實驗，確定合適的超聲時間，結果見圖1。

由圖1可知，隨著超聲時間的延長，SOD比活力也增加，當超聲時間為15min時，提取液中SOD比活力為76.1U/mg。繼續延長超聲時間，SOD比活力隨之降低，這可能是由于超聲波的高強度機械作用和空化作用使SOD變性失活，因此，確定最佳超聲時間為15min。

2.1.2 超聲功率對SOD提取的影響 準確取15mL自然解凍的紅細胞置于試管中，加入以3∶1的蒸餾水，攪拌15min后，在超聲功率分別為：160、180、200、220、240W溫度40℃條件下處理15min，測蛋白質的濃度和酶的活性，結果見圖2。

通常超聲功率越高，越容易獲得較大的聲強，但超聲功率對SOD比活力的影響不能一概而論，而要考慮超聲波與介質相互作用的程度和提取物的性質。由圖2可知，隨著超聲功率的增加，SOD比活力不斷增加，當超聲功率在220W時，提取液中SOD比活力為81.1U/mg；而繼續增加超聲功率，SOD比活力隨之降低，因此，選擇超聲功率為220W。

2.1.3 超聲溫度對SOD提取的影響 準確取15mL自然解凍的紅細胞置于試管中，加入以3∶1的蒸餾水，攪拌15min后，在超聲功率220W，超聲溫度分別為：15、30、45、60、75℃下分別處理15min，測蛋白質的濃度和酶的活性，結果見圖3。

從圖3可知，超聲溫度在30℃時，SOD比活力為78.2U/mg，高于30℃后SOD比活力緩慢下降，因為溫度高，細胞膜在未破碎、SOD未溶出時，細胞已經變性，導致了溶液中SOD含量下降，比活力降低，另外，高溫也會導致SOD變性，從而使SOD的比活力降低。

2.2 以SOD比活力為響應值的響應面實驗

利用統計分析Design-Expert軟件進行Box-Behnken實驗，結果見表2。

2.2.1 數學模型的建立[10]根據表2所得的實驗數據，采用響應面統計方法對實驗數據擬合，建立SOD比活力與超聲時間、超聲功率、超聲溫度三因子的二次多項數學回歸方程：

回歸模型方差分析見表3，模型的p=0.0003＜0.01，說明對馬血中SOD建立的回歸模型是極顯著的，失擬項p=0.0971＞0.05不顯著，相關系數R2=0.9639，表示模型的擬合度良好，實驗誤差較小。三因素對SOD比活力的影響順序為：超聲溫度＞超聲時間＞超聲功率。因此可以選用此模型對SOD的超聲波提取工藝進行分析和預測，能確定所得到的二次回歸方程模型是合適的。

2.2.2 響應面分析與優化 圖4是以SOD比活力為響應值的響應曲面圖，通過對相應的等高線及響應曲面分析，由Design-Expert軟件給出響應圖的預測值，SOD比活力78.3739U/mg，其對應的工藝參數是：超聲時間15.02min、超聲功率220.17W、超聲溫度30.56℃。

對回歸模型進行數學分析，交互項AC對SOD比活力的影響顯著。隨著超聲時間和超聲溫度的上升，SOD比活力呈現先上升后下降的趨勢。

在模型給出的條件下，按實際條件確定：超聲時間15min、超聲功率220W、超聲溫度31℃，在此條件下做3組平行實驗，以檢驗模型的準確性。所得的SOD比活力分別為77.5、76.9、78.1U/mg，平均值為77.5U/mg。驗證值77.5U/mg和預測值78.3739U/mg非常接近，說明回歸方程可以較真實的反映各篩選因素的影響，建立的模型與實際情況比較吻合，再次證明該回歸模型的可行性。

3 結論

采用超聲波萃取法從馬血中提取SOD，利用實驗設計軟件Design-Expert，通過響應面分析法建立馬血SOD超聲波提取工藝的數學回歸模型，并對各因子對SOD比活力的影響進行了分析，得出影響馬血SOD提取的各因素順序依次為：超聲溫度＞超聲時間＞超聲功率；馬血SOD超聲波提取工藝的最佳參數為：超聲時間15min、超聲功率220W、超聲溫度31℃，在此條件下，SOD比活力為77.5U/mg。

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