中心組合設計優化酶法提取胖大海多糖工藝

孫 鵬，裴國亮，孫先鋒

（1.西安工程大學環境與化學工程學院，陜西西安 710048；2.西北農林科技大學旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌712100）

胖大海為梧桐科蘋婆屬植物（Sterculia lychnophora Hance）的干燥成熟種子，是一種傳統的清咽潤喉的中藥材，也是衛生部公布第三批藥食兩宜的資源，其具有清熱潤肺、利咽解毒、潤腸通便的功效。臨床用于肺熱聲啞、干咳無痰、咽喉干痛、熱結便閉、頭痛目赤的治療[1-2]。目前國內外對胖大海的研究較少，僅限于做茶飲、甜點和含片等清咽潤喉的保健品，開發利用程度較低，缺乏對其活性成分的系統研究與利用。多糖是胖大海的主要生物活性成分[3]，目前對其多糖的提取主要有水煎法、超聲波法和微波法[4-5]，但酶法提取尚未見報道，本文以胖大海為原料，運用中心組合實驗設計及響應面分析法對胖大海多糖的纖維素酶提取工藝進行優化，確定纖維素酶提取胖大海多糖的最佳參數，為其進一步的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胖大海 購自陜西西安老百姓大藥房；纖維素酶 購自肇東國科北方酶制劑有限公司（10000U/g）。

紫外可見分光光度計 上海光譜廠；LG10-2.4型離心機 北京醫用離心機廠；SHZ-III循環水式真空泵 上海亞榮生化儀器廠；FW-200高速萬能粉碎機 北京中興偉業儀器有限公司；電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；RE-52A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 胖大海多糖的提取 將胖大海置于干燥箱中

60℃干燥，自然冷卻后粉碎過60目篩，精密稱取5g粉末，加入一定體積蒸餾水，將pH調至4.8，加入一定的纖維素酶攪勻，并置于恒溫水浴搖床中，轉速設定為180r/min，酶解提取完成后將提取容器置于95℃水浴中滅酶6min，再用旋轉蒸發儀于70℃下濃縮，加入濃縮液1/4體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）[6]，振蕩處理15min，離心獲得（4000r/min，3min）上清液，再加入3倍體積的無水乙醇，充分攪拌靜置過夜，離心（5000r/min，10min）得沉淀，沉淀用75%乙醇水溶液分散，再離心，棄去上清液，以此法清洗可除去沉淀中夾帶的少量單糖和低聚糖等水溶性雜質。沉淀洗2次后再次離心后的沉淀用蒸餾水溶解并定容到25mL，最后用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

1.2.2 胖大海多糖測定及得率計算 胖大海多糖的測定采用苯酚-硫酸法[7]，以葡萄糖（mg/mL）作為標準品測定提取液中復水多糖液中胖大海多糖的含量，葡萄糖標準曲線為y=0.2756x－0.0076（R2=0.9983）。胖大海多糖的得率計算如下：Y（%）=[（C×V）/M]×100，式中：Y為胖大海多糖得率（%）；C為由回歸方程求得的胖大海多糖濃度（mg/mL）；V為復水多糖液體積（mL）；M為胖大海質量（g）。

1.2.3 單因素及響應面實驗設計 通過單因素實驗，分別考察料液比、纖維素酶添加量、酶解溫度和時間對胖大海多糖得率的影響。根據單因素實驗結果，采用中心組合實驗設計和響應面法優化確定料液比、纖維素酶酶添加量和酶解時間對響應值的影響。設定中心組合實驗設計各因素水平編碼值見表1。

2 結果與分析

2.1 料液比對胖大海多糖得率的影響

稱取胖大海粉末5.0g，稱取5組，每組2份，將料液比分別調至1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，將pH調至4.8，加入纖維素酶1.5%，45℃浸提2h，按1.2.1提取胖大海多糖，結果如圖1所示。

由圖1可知，隨著料液比的逐漸增加，胖大海多糖得率逐漸增加，料液比由1∶10增大到1∶30時，多糖得率顯著增加，繼續增加料液比后，多糖得率增加緩慢，這主要是由于隨著料液比的增加，胖大海內部和溶液主體的多糖濃度差增大，導致推動力增大，從而有利于多糖的溶出。當料液比為1∶30時，大部分多糖已溶出，繼續增加料液比，導致單位體積提取液中多糖濃度降低，不利于后續濃縮工作，且對多糖的得率無顯著性增加。

2.2 纖維素酶添加量對胖大海多糖得率的影響

準確稱取胖大海粉末5.0g，稱取5組，每組2份，料液比1∶25，將pH調至4.8，加入纖維素酶，使其濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%（W∶V），45℃浸提2h，按1.2.1提取胖大海多糖，結果如圖2所示。

由圖2可知，隨著纖維素酶濃度的增加，胖大海多糖得率增大。當加酶量大于2.0%時，繼續增加酶濃度，多糖得率沒有明顯提高，說明在該底物濃度下，單位底物上的酶濃度已經趨于飽和，胖大海多糖已溶出，繼續增加纖維素酶用量，對胖大海多糖得率沒有顯著影響。

2.3 酶解溫度對胖大海多糖得率的影響

稱取胖大海粉末5.0g，稱取5組，每組2份，料液比1∶25，將pH調至4.8，加入纖維素酶1.5%，分別在40、45、50、55、60℃下浸提2h，按1.2.1提取胖大海多糖，結果如圖3所示。

由圖3可知，當酶解溫度低于50℃時，胖大海多糖得率隨著溫度的升高而顯著增加；當溫度高于50℃時，多糖得率隨溫度升高而降低，當溫度高于55℃時，多糖得率迅速降低。這是因為酶是一類具有最適反應溫度范圍的物質，過低溫度會抑制酶的催化活力，過高溫度會導致酶失活。根據單因素實驗確定最佳酶解溫度為50℃。

2.4 酶解時間對胖大海多糖得率的影響

稱取胖大海粉末5.0g，稱取5組，每組2份，料液比1∶25，將pH調至4.8，加入纖維素酶1.5%，45℃下分別提取1.0、1.5、2.0、2.5、3h，按1.2.1提取胖大海多糖，結果如圖4所示。

由圖4可知，胖大海多糖得率隨著酶解時間的增加不斷提高，但當提取時間大于2h后，多糖得率增加趨于平緩，說明增加酶解時間可以使纖維素酶對細胞壁中的多糖充分溶出，但酶解時間過長，酶的催化活性降低，進而對多糖的得率影響不大。

2.5 胖大海多糖提取工藝優化

為優化單因素實驗得到的工藝條件，采用中心組合實驗設計對酶解工藝的主要影響因素進行優化實驗。中心組合實驗設計及結果見表2。

應用Design Expert 8.06軟件響應面分析程序對實驗結果進行回歸擬合，得到二次多元回歸模型為：

對該模型的方差分析見表3，由表3可知，模型p＜0.0001，失擬項p=0.1869＞0.05，相關系數R2=0.9960，表明模型的相關性很好，R2Adj相關系數=0.9424，表明響應面的94.24%的變化可以由此模型解釋，模型與實際情況擬合的很好。變異系數CV越低，實驗的可信度和精確度越高，變異系數CV=4.41，實驗數據可靠，分析結果可信，因此可以用此回歸方程對實驗結果進行分析和預測。

由表3還可知，纖維素酶酶解提取胖大海多糖的工藝參數中，影響多糖得率的因素為：纖維素酶添加量＞酶解時間＞料液比，其中纖維素酶添加量（X1）和酶解時間（X3）達到極顯著水平，料液比（X2）達到顯著水平，料液比與酶解時間之間存在交互作用，且達到極顯著水平。

圖5～圖7為各因素對響應值（胖大海多糖得率）影響的響應面圖，其直觀地反映出各因素交互作用對響應值的影響，等高線的圓形表示二因素交互作用不顯著，橢圓表示二因素交互作用顯著[8]。由圖7可知，料液比和酶解時間的交互作用顯著，而圖5、圖6中兩因素之間的交互作用不顯著。采用Design Expert 8.06軟件分析，得到響應面胖大海多糖最大值點對應的各因素的水平分別為纖維素酶添加量1.92%，料液比1∶30.5，酶解時間126min，此時胖大海多糖最大理論得率為8.16%。采用上述最優條件進行胖大海多糖提取實驗，實際獲得5組平行實驗平均多糖提取率為7.92%±0.09%，與理論預測值誤差為1.84%～4.04%，說明該模型預測性很好，運用中心組合設計及響應面分析法優化得到的模型參數準確可靠，具有實踐指導意義。

3 結論

影響胖大海多糖得率的工藝參數按主次順序排列為纖維素酶添加量＞酶解時間＞料液比。響應面法優化的最佳提取工藝條件為纖維素酶添加量1.92%，料液比1∶30.5，pH4.8，50℃下酶解時間126min，在此條件下，胖大海多糖得率為7.92%±0.09%。

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