動態超高壓微射流技術在三葉青葉黃酮的提取中的應用

孫 永，李紅艷，劉小如，鄧澤元

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047）

三葉青（Radix Tetrastigmae）為葡萄科植物三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum Dielset Gilg）的塊根或全草，為我國特有珍稀植物[1]。分布于我國浙、贛、閩、粵、川、云、黔等省區[2]，可活血止痛、祛風化痰、清熱解毒，用于肺炎、高熱驚厥、哮喘、咽痛、肝炎、瘰疬、月經不調、風濕等癥。三葉青提取物有消炎鎮痛、抗病毒等作用，廣泛應用于民間治療病癥[3-5]。據報道，三葉青的化學成分主要為黃酮類化合物、還原糖、淀粉、氨基酸、甾類化合物等[6]。而三葉青葉片的的化學成分的報道相對較少，其主要含有黃酮類化合物和花青素類[7]。作為一種新興的超微細化技術，動態超高壓微射流技術能對物料產生強烈剪切、高速撞擊、高頻振蕩、壓力瞬間釋放等一系列的綜合作用，從而導致細胞破碎，與此同時對活性成分幾乎沒有影響，并且能起到很好的超細化和均一化效果[8]。目前，動態超高壓微射流技術被用于滅菌[9]、多糖提取[10]、蛋白質改性[11-12]及淀粉改性[13-14]。運用動態超高壓微射流技術來提取黃酮的研究相對較少。本實驗采用響應面法優化動態超高壓微射流技術提取三葉青葉黃酮的工藝條件，提高三葉青葉黃酮的得率，為全面開發和利用三葉青這一珍稀物種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三葉青 中國三葉青育苗基地提供，60℃干燥，粉碎后過200目篩；蘆丁標準品（純度≥95%）中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心；其余試劑 均為國產分析純。

M-700微射流均質機 美國Microfluidics公司；GY50-6S高壓均質機 上海華東高壓均質機廠；722G可見分光光度計 上海精科儀器有限公司；METTLER-TOLEDO AL104電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DFY-500搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 準確稱取蘆丁標準品5mg，溶解于95%乙醇中，再移入50mL容量瓶并用乙醇定容至刻度，得到濃度為0.1mg/mL的蘆丁標準液。分別吸取標準液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL置于10mL比色管中，并用95%乙醇加至5mL，加入5%的NaNO2溶液0.5mL，搖勻，放置6min后，加入10%的Al（NO3）3溶液0.5mL，搖勻，放置6min后，加入4%的NaOH溶液4mL，搖勻，放置15min，以試劑作空白參比液，在510nm處測定其吸光度，以蘆丁質量濃度（C）為橫坐標、吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2 三葉青葉黃酮提取的流程 三葉青葉粉末→60℃烘干（12h）→乙醇浸潤（過夜）→高壓預均質（30MPa，2次）→動態超高壓微射流均質→乙醇冷凝回流提取（70℃，2次，合并提取液）→離心→抽濾→測定吸光度→計算黃酮得率。

1.2.3 三葉青葉黃酮得率的計算 取0.5mL提取液，按照1.2.1的方法測定其在510nm下的吸光度，按照下式計算黃酮的得率。

1.2.4 單因素實驗 乙醇濃度，提取溫度、時間、次數，微射流均質壓力、次數及料液比為影響三葉青葉黃酮得率的因素。通過考察文獻并結合前期研究，確定液料比為22mL/g，提取次數為兩次。本實驗主要研究乙醇濃度、提取溫度和時間、微射流均質壓力和次數五個因素對三葉青葉黃酮得率的影響。

1.2.5 響應面實驗設計 以單因素實驗為基礎，根據Box－Behnken的中心組合原理設計四因素三水平，選擇乙醇濃度、提取溫度和時間、微射流均質壓力為自變量，并以X1、X2、X3、X4來表示，以－1、0、1代表不同變量水平進行編碼[15]。實驗因素水平及編碼見表1。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線回歸方程：A=6.7657C+0.0009，R2=0.9997，線性范圍：0～0.05mg/mL，在此范圍內其吸光度值與濃度呈良好的線性關系。

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對三葉青葉黃酮得率的影響 分別稱取5.00g三葉青葉粉末，按液料比22mL/g加入分別為50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇，浸泡過夜，經30MPa預均質后，立刻在100MPa微射流壓力下處理2次，70℃水浴提取1.5h，提取兩次。

由圖1可知，三葉青葉黃酮得率隨著乙醇濃度的上升而增大，并且在乙醇70%時達到最大值；隨著濃度的繼續上升，黃酮得率緩慢下降，其原因可能是當乙醇濃度大于70%，葉綠素等脂溶性雜質溶出影響黃酮類物質的溶解。因此，選擇乙醇濃度為70%較合適。

2.2.2 提取溫度對三葉青葉黃酮得率的影響 提取溫度選擇50、60、70、80、90℃，以70%乙醇提取，其余條件同2.2.1。

由圖2可知，三葉青葉黃酮得率隨著提取溫度的上升而增加，且能顯著影響三葉青葉黃酮得率。但當溫度超過70℃后，黃酮得率隨著溫度的上升而緩慢下降，其原因可能是三葉青葉黃酮中的某些活性成分被氧化分解。因此，選擇提取溫度為70℃較合適。

2.2.3 提取時間對三葉青葉黃酮得率的影響 提取時間選擇0.5、1、1.5、2、2.5h，以70%乙醇提取，其余條件同2.2.1。

由圖3可知，三葉青葉黃酮得率隨著時間的延長先增加而后趨于平緩，在1.5h內時，黃酮得率升高較快，而超過1.5h后，黃酮得率變化不大。因此，選擇提取時間為1.5h較合適。

2.2.4 微射流均質壓力對三葉青葉黃酮得率的影響

微射流均質壓力選擇60、80、100、120、140MPa，以70%乙醇提取，其余條件同2.2.1，并與普通提取和30MPa預均質后提取比較。

由圖4可知，相對于普通提取和高壓預均質后提取，微射流均質后提取使得三葉青葉黃酮得率隨著均質壓力的上升而顯著提高，其原因可能是均質壓力越大細胞破碎程度越高，從而導致黃酮類物質更完全的溶出。黃酮得率在壓力為100MPa時達到最大值。而后隨著均質壓力的上升黃酮得率趨于平緩且略微下降。因此，微射流均質壓力100Mpa時，黃酮得率最大。

2.2.5 微射流均質次數對三葉青葉黃酮得率的影響

微射流均質次數選擇1、2、3、4、5次，以70%乙醇提取，其余條件同2.2.1。

由圖5可知，三葉青黃酮得率開始時隨著均質次數緩慢上升隨后趨于平緩，但變化不大。因此，選擇微射流均質次數為2次較合適。

2.3 響應曲面優化實驗的結果與分析

2.3.1 響應面優化實驗結果 響應面優化實驗設計及結果見表2。通過SAS v9.2軟件對實驗數據進行回歸分析，根據Box－Behnken的中心組合設計原理，四因素三水平實驗的取值見表1，共有27個實驗，實驗號1～24為析因實驗，后面3個為中心實驗。其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3、X4所構成的三維頂點，零點為區域的中心點，零點實驗重復3次，用以估計實驗誤差。

2.3.2 擬合模型的建立 對實驗數據經回歸擬合后，得到X1（乙醇濃度）、X2（提取溫度）、X3（提取時間）和X4（微射流均質壓力）與Y（三葉青葉黃酮得率）之間的回歸方程為：

2.3.3 方差分析 對三葉青葉黃酮得率進行響應曲面回歸分析，其結果見表3。

由表3可知，各因素對三葉青葉黃酮得率的影響為：微射流均質壓力＞提取溫度＞提取時間＞乙醇濃度。本模型的p＜0.0001，說明該模型具有高度的顯著性。本實驗中X4（微射流均質壓力）的一次項對三葉青葉黃酮得率呈極顯著水平，X2（提取溫度）的一次項呈顯著影響。X1（乙醇濃度）、X2（提取溫度）、X3（提取時間）的二次項呈顯著影響。而X1、X2、X3、X4四者之間的交互作用影響不顯著。同時，該模型的R2=0.9588，且模型誤差顯著、失擬誤差不顯著，變異系數（CV=2.285）較小，說明此模型能夠較好的擬合實際實驗。因此，可用該模型代替實驗真實點對結果進行分析和預測。

2.3.4 最佳條件的確定及驗證性實驗 通過SAS軟件分析得到微射流均質提取三葉青葉黃酮的最佳條件為：乙醇濃度75%、提取溫度70℃、提取時間1.5h、微射流均質壓力120MPa，在此條件下三葉青葉黃酮得率的理論預測值為3.52%。然后，按照上述條件做3次平行實驗進行驗證，得到三葉青葉總黃酮得率的平均值為3.49%。與理論預測值3.52%相比誤差僅為0.03%，因此，采用響應曲面法得到的最佳條件具有實用價值。

3 結論

本實驗研究了動態超高壓微射流對三葉青葉黃酮得率的影響。通過響應曲面法確定了微射流均質熱醇提取三葉青葉黃酮的最佳條件：乙醇體積75%、提取溫度70℃、提取時間1.5h，微射流均質壓力120MPa、微射流均質次數2次、液料比22mg/mL、提取次數2次。此時，三葉青葉黃酮得率為3.49%。

[1]江蘇新醫學院，中藥大辭典[M].下冊.上海：上海人民出版社，1977：2123.

[2]中國醫學科學院藥物研究所中藥志[M].第二冊.北京：人民衛生出版社，1984：219.

[3]陳科敏，石森林，黃林群，等.三葉青總黃酮的提取工藝研究[J].制劑技術，2009，18（11）：33.

[4]錢麗華.三葉青的離體快速繁殖[J].植物生理學通訊，2008，44（1）：121－122.

[5]鄭軍獻，胡軼娟，梁衛青，等.紫外可見分光光度法測定三葉青中總黃酮含量[J].中國中醫藥科技，2009（2）：126.

[6]楊學樓，羅經，孫松柏，等.三葉青抗病毒作用的研究[J].湖北中醫雜志，1989（4）：40.

[7]Abdul L Flavonols，Ellagic Acid and Anthocyaanidins in Leaves of Some Malaysian Vitaceae[J].Malaysian Journal of Medical Sciences，1980（6）：95.

[8]LIU Wei，LIU Jianhua，LIU Chengmei，et al.Activation and conforma－tional changes of mushroom polyphenoloxidase by high pressure microfluidization treatment[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10（2）：142－147.

[9]劉成梅，鐘業俊，劉偉，等.瞬時高壓作用對谷草桿菌的殺滅模型[J].食品科學，2006，27（6）：96－99.

[10]涂宗財，王艷敏，劉成梅，等.動態超高壓微射流技術在玉米花粉多糖提取中的應用[J].食品工業科技，2010，31（6）：212－214.

[11]涂宗財，王輝，劉成梅，等.動態超高壓微射流對蛋清蛋白溶液的粒度和流變性影響[J].食品科學，2007，28（6）：27－29.

[12]涂宗財，張雪春，劉成梅，等.超高壓微射流對花生蛋白結構的影響[J].農業工程學報，2008，24（9）：306－308.

[13]涂宗財，張博，任維，等.超高壓微射流對玉米淀粉機械力化學效應的研究[J].食品工業科技，2008（2）：172－174.

[14]涂宗財，朱秀梅，陳鋼，等.動態超高壓微射流對糯米淀粉結構的影響[J].光譜學與光譜分析，2010，30（3）：834－837.

[15]黃璞，謝明勇，聶少平，等.響應曲面法優化微波輔助提取黑靈芝孢子多糖工藝研究[J].食品科學，2007，28（10）：200－203.