乳清蛋白-麥芽糖糊精的Ma i l l a r d反應復合物制備β-胡蘿卜素納米乳液

李 燕，劉成梅，劉 偉，鐘俊楨

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，南昌大學中德食品工程中心，江西南昌330047）

乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀后存在于乳清中的蛋白質，為全價蛋白，易于消化吸收，具有很高的營養價值。乳清蛋白具有一些突出的功能特性，可作為乳化劑、穩定劑、保濕劑、起泡劑等應用于食品加工中。乳清蛋白的一些特點如易在等電點附近發生聚合和沉淀，限制了其在食品工業中的應用[1－2]。通過Maillard反應與還原糖類共價復合，乳清蛋白的多種性能可得到改善。由于Maillard反應的反應條件溫和，且無需添加化學試劑，被視為一種安全、有效的蛋白質改性方法。目前對乳清蛋白與多糖的Maillard反應復合物（Maillard Reaction Products，MRPs）的研究主要集中在提高蛋白質乳化能力[1]、乳化穩定性[3]及熱穩定性[4]等功能上。食品工業中乳液在應用時往往需要在油相中溶解一些疏水的活性物質如β－胡蘿卜素。對油相中活性物質的保護，在乳液制備中非常重要。相對小分子乳化劑，蛋白乳化劑能夠更好地保護乳滴中易降解的物質，而蛋白與多糖的MRPs可在提高乳液物理穩定性的同時進一步提高油相中β－胡蘿卜素的化學穩定性[5]。因此，本文擬通過在溫和條件下的Maillard反應制備WPI與MD的MRPs，將其用于制備β－胡蘿卜素的納米乳液，并考察納米乳液的物理穩定性及MRPs對油相中β－胡蘿卜素是否存在保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

乳清分離蛋白（Whey Protein Isolate，WPI）蛋白含量85%，上海愛蘭比亞營養品有限公司；麥芽糖糊精（Maltodextrin，MD）Sigma－Aldrich，USA，DE值16.5～19.5，平均分子量約1000u；玉米油 購自當地超市；β－胡蘿卜素，Fluka，USA，純度≥97%；其余試劑 為分析純。

Ultra－Turrax T25 Basic高速乳化分散機 德國Janke&Kunkel KG.IKA－werk公司；T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；NCJJ－0.2/150超高壓均質機 廊坊通用機械有限公司；NICOMP 380/ZLS納米粒度儀 美國PSS公司；CR－10色差儀 日本，柯尼卡美能達公司。

1.2 乳清蛋白乳液的制備

WPI溶解于磷酸鹽緩沖液（pH7.0，10mmol/L）中，同時加入0.02%的NaN3，磁力攪拌3h以上，使蛋白充分溶脹，形成水相。一定量的玉米油為油相，在分散機高速剪切2min制備得到粗乳液，然后在高壓微射流儀中均質乳化，得到納米乳液，用于進一步分析。

1.3 WPI-MD MRPs的制備[6]

將WPI（5%）與MD（10%）分別溶解于超純水中，磁力攪拌過夜，使溶質完全水化。將WPI與MD溶液按照質量比1∶2混合，磁力攪拌3h以上，使蛋白和多糖分子充分接觸后凍干。凍干的蛋白多糖混合物置于底部裝有飽和KBr溶液（相對濕度79%）的玻璃干燥器中，80℃反應2h，制備得到WPI－MD的MRPs，所得產物置于－18℃冰箱儲存。

1.4 WPI-MD MRPs接枝度的測定

參照Habeeb[7]的方法稍作改進。取0.3mL蛋白溶液（濃度1mg/mL），加入2mL PBS緩沖液（50mmol/mL，pH8.2）和1mL TNBS溶液，渦旋振蕩混勻，在40℃水浴中避光反應2h，然后取出加入1mL 0.1g/100mL的SDS溶液和1mL 0.1mol/mL HCl終止反應，室溫下放置30min，于340nm波長處測定吸光度。按照式（1）計算接枝度。

式中：A0為接枝反應前樣品的吸光度；At為反應后樣品的吸光度。

1.5 β-胡蘿卜素乳液的制備

稱取一定量β－胡蘿卜素置于玉米油中，避光60℃磁力低速攪拌1h，使其完全溶解，形成油相（β－胡蘿卜素濃度為0.05%）；將乳化劑加入pH3.2，50mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中，同時加入0.02%NaN3用于防腐，磁力攪拌3h以上，使乳化劑完全水化（乳化劑濃度為蛋白當量0.5%）。高速剪切攪拌，同時滴加5%的油相于水相中，9000r/min剪切3min，形成粗乳液。將制備的粗乳液通過高壓微射流儀進一步均質得到β－胡蘿卜素乳液，將制備乳液迅速避光保存。

制備的β－胡蘿卜素乳液用50mmol/L，pH3.0檸檬酸鹽緩沖液適當稀釋，采用NICOMP 380/ZLS納米粒度儀室溫分析乳液粒徑大小（平均粒徑）與分布（多分散系數，PDI）。

1.6 β-胡蘿卜素含量的測定

β－胡蘿卜素標準曲線繪制：準確稱取20mg β－胡蘿卜素標品，以少量氯仿溶解，加入正己烷定容至100mL為1號母液。取1號母液4mL置于50mL容量瓶中，定容，得到2號母液。分別取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 2號母液置于容量瓶中，定容至10mL，測450nm處吸光度。

乳液中β－胡蘿卜素含量測定[8]：準確稱取1g乳液，正己烷+乙醇（3∶2）混合溶劑連續提取3次，合并上相，定容至10mL，以正己烷為參比，測定450nm處吸光度，結果通過標準曲線算出。

2 結果與討論

2.1 WPI乳化性能的考察

分別考察了WPI乳液制備參數對WPI乳液物理特性的影響，包括WPI濃度、微射流均質壓力、均質次數的影響。

按照1.2的方法制備乳清蛋白乳液（油相質量比10%，微射流壓力120MPa，5次循環），考察WPI穩定乳液的粒徑分布隨WPI濃度的變化。如圖1所示，當WPI的濃度為0.5%～2.5%時，隨著WPI濃度的增加，乳滴平均粒徑變小，但變化幅度不大。WPI的濃度大于0.5%時，蛋白濃度的升高對乳滴粒徑的減小貢獻不大，這一結果與文獻報道的結果類似，即當WPI濃度大于0.5%時，乳液中油水界面被WPI飽和，乳液粒徑變化與WPI濃度無關[5]。而WPI濃度為0.5%，乳液較易分層，為MRPs對乳液穩定性的提高提供了提升空間，因此本文采用蛋白當量濃度為0.5%進行β－胡蘿卜素納米乳液的制備。隨著WPI濃度的升高，乳液的PDI值變化不大，即所得乳液隨WPI濃度升高其分布均勻性變化不大，進一步表明乳液油水界面在WPI為0.5%時已基本被蛋白分子飽和。

當WPI濃度0.5%，油相5%，微射流5次循環時，考察微射流均質壓力對納米乳液粒徑的影響，結果如圖2所示。結果表明固定循環次數為5次，隨著微射流均質壓力增大，乳滴粒徑逐漸減小。當壓力大于166MPa時，乳滴的粒徑變化不大，但PDI值明顯減小。乳狀液屬于動力學穩定體系，高壓均質能夠為乳液提供一定的能量輸入，使乳液分散體系能夠在一定時間內保持穩定。隨著輸入功率的加大（即均質壓力和均質次數的共同影響），乳滴粒徑先下降后上升[9]。而本文的結果并未呈現這一趨勢，可能是由于在本文的實驗條件下，均質過程輸入的功率并未達到破壞乳液穩定性的臨界值。盡管在高壓區乳液有較小的粒徑，較窄的粒徑分布，考慮到壓力過大會加速β-胡蘿卜素的降解，應選用低壓段制備β-胡蘿卜素納米乳液。當均質壓力為60MPa時，乳滴平均粒徑為330nm（一般納米乳液的平均粒徑小于500nm），可視為納米乳液，因此選用60MPa為制備β-胡蘿卜素納米乳液的工作壓力。

當WPI濃度0.5%，油相5%，微射流壓力60MPa時，考察微射流均質次數對納米乳液粒徑的影響，結果如圖3所示，均質次數對乳液平均粒徑影響不大，但PDI值波動較大。當均質次數小于三次時，PDI值極不穩定，說明乳液體系未能形成較為穩定的分散系統。當均質次數大于或等于三次時，乳液的PDI值相對較為穩定。同樣考慮到過大的輸入功率加速敏感物質的降解，選用均質次數為3次，制備β-胡蘿卜素納米乳液。

2.2 WPI-MD的MRPs的制備

將制備得到的WPI-MD MRPs（HWMD）與凍干WPI（WPI）、同樣條件下加熱的WPI（HWPI）、凍干的WPI與MD的混合物（WMD）相比。凍干WPI呈白色片狀疏松結構。加熱后的WPI疏松度降低，顏色變化不大。WPI與MD的凍干混合物呈白色粉末，結構比較緊實。而WPI-MD的MRPs結構更為致密，顏色為淡黃褐色，說明發生了Maillard反應。

由于Maillard反應發生于還原糖上的羰基與ε-氨基之間（蛋白質中主要為賴氨酸），所以蛋白質的接枝度可以通過測其游離氨基酸含量進行表征。如表1所示，WPI、HWPI的接枝度未檢出（原始WPI與HWPI游離氨基酸含量無顯著差異。本文以原始WPI的游離氨基酸含量為參照計算接枝度，因此WPI與HWPI樣品的接枝度視為未檢出），而MRPs具有高達44.8%的接枝度。此外，結果顯示，WPI與MD混合物亦有高達9.1%的接枝度，說明有可能在凍干、混合過程發生了一定程度的Maillard反應。

2.3 β-胡蘿卜素乳液的制備與表征

β-胡蘿卜素對光及其敏感，熱穩定性較好，需要在避光加熱條件下使其充分溶解于油中。

2.3.1 β-胡蘿卜素乳液的物理穩定性 如圖4所示，納米乳液具有一定的物理穩定性。WPI與HWPI的物理穩定性相差不大。樣品制備后立即測定，MD的加入可顯著降低乳液的平均粒徑（p＜0.05）。僅用WPI為乳化劑時乳滴平均粒徑高達410nm，而與MD的混合物乳滴粒徑為348nm，經加熱復合后，其平均粒徑進一步降低為284nm。樣品在40℃避光保存40d后，乳液粒徑變化不大，說明形成了較為穩定的分散體系。觀察樣品的外觀發現，HWMD穩定的乳液在經過40d室溫儲藏后，其濁度隨試管的上下分布基本一致，而其他三個樣品的下層均出現濁度隨高度變大的現象（數據未顯示）。蛋白質與多糖的MRPs降低乳液粒徑的結論多有報道[1，3，10]。一般認為MRPs吸附在油水界面上，連接在蛋白分子上的糖鏈伸入水相中，使界面膜的厚度增加。同時，包裹與蛋白質膜外層的多糖膜可以增加乳滴靠近的立體位阻，從而提高乳液的物理穩定性[3]。

2.3.2 β-胡蘿卜素乳液的化學穩定性 考察納米乳液中β-胡蘿卜素的化學穩定性，結果如圖5所示。WPI-MD的MRPs非但沒有對包埋其中的β-胡蘿卜素起保護作用，反而加速了其降解。40℃避光保存40d后，HWMD穩定的乳液中β-胡蘿卜素的含量僅為初始含量的7.1%±1.1%。而加熱WPI與WPI-MD的混合物顯示出對β-胡蘿卜素良好的保護能力，同樣儲藏條件下，β-胡蘿卜素含量分別高達30.1%±1.3%和29.0%±1.3%。Xu等[5]用WPI與甜菜果膠的MRPs制備β-胡蘿卜素納米乳液，發現共價復合物穩定的乳液體系可大幅提高乳液中β-胡蘿卜素對光曝、儲藏的化學穩定性，同時降低乳液的平均粒徑。MRPs中使用的多糖分子鏈越長，形成的界面膜越厚，對油相中的物質保護作用應該越明顯。本文的使用的MD平均分子量為1000u，遠小于果膠的分子量，其對β-胡蘿卜素的保護作用小于WPI-甜菜果膠是可以預見的。然而，WPI-MD的MRPs對β-胡蘿卜素的保護作用尚不如凍干WPI，說明MRPs對油相中的β-胡蘿卜素是否存在保護作用可能并非多糖層的厚度決定，其潛在機理有待進一步研究。

3 結論

本文系統考察了乳液制備參數對乳液粒徑分布及穩定性的影響，同時制備了WPI-MD的MRPs。以此為基礎，制備了WPI-MD MRPs穩定的β-胡蘿卜素納米乳液，并進一步考察了乳液的物理穩定性及β-胡蘿卜素的化學穩定性。WPI-MD的MRPs能夠顯著降低納米乳液的粒徑，并提高納米乳液的穩定性，但并不能同時提高蛋白乳化劑對油相中β-胡蘿卜素的保護作用。相反，WPI-MD的MRPs加速了油相中β-胡蘿卜素的降解，其機理有待進一步研究。

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