預處理對核桃肽抗氧化活性的影響

呂 瑩，楊柏崇，王 瑩，陳 怡，陳文茜，韓 濤

（1.北京農學院食品科學與工程學院，農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206；2.譜尼測試科技股份有限公司食品實驗室，北京100080）

核桃富含不飽和脂肪酸、核桃蛋白和內皮多酚等成分，對健康調節起著重要作用，目前核桃的深加工產品主要有核桃油、核桃乳和核桃粉等。核桃粕是核桃榨油后的副產物，約含有30%～50%的蛋白質[1－2]。核桃蛋白主要由四類蛋白質構成：白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，分別占核桃蛋白總量的6.81%、17.57%、5.33%和70.11%[3]。大量研究表明，核桃蛋白的體外酶解物：核桃肽具有抗氧化活性[1－2，4]。現有的研究發現，對原料進行預處理，如加熱或采用物理場，可以破壞蛋白質、多糖等生物大分子物質的空間結構，使其易于被酶解、提高目標產物的得率，或增強酶解物的功能性。加熱、微波和超聲波處理是目前常用的蛋白質變性的方法。對經過超聲波預處理的燕麥蛋白進行酶解，發現其產物燕麥肽的ACE抑制活性顯著增加[5]；而采用微波輔助水解法制備絲素肽能大大降低能耗，節省成本[6]。目前有關核桃肽的抗氧化活性研究多集中在酶解條件的優化上[1，7－8]，不同的預處理方法對核桃肽抗氧化活性的影響未見報道。因此，本研究考察了直接酶解、堿提、加熱、微波、超聲波預處理高溫和低溫脫脂核桃粕對核桃肽抗氧化活性和得率的影響，以及由兩種核桃粕提取核桃蛋白后進行酶解得到核桃肽抗氧化活性的差異，為核桃蛋白的應用提供基礎，也為核桃深加工技術提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

低溫脫脂核桃粕（液壓冷榨法制油）河北省石家莊京丸有限公司；高溫脫脂核桃粕（螺桿擠壓法高溫榨油） 北京綠湖工貿公司惠贈；中性蛋白酶和堿性蛋白酶 諾維信公司惠贈；風味蛋白酶、酸性蛋白酶和復合蛋白酶 日本天田野酶制劑有限公司；其他試劑 均為分析純。

Wave－1000型微波紫外超聲波合成萃取反應儀上海新儀微波化學科學科技有限公司；PP－25型pH計 德國賽多利斯；FD－1C－50型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；LXJ－ⅡB型離心機 上海安亭科學儀器廠；UV－1800型紫外－可見分光光度計 日本島津。

1.2 低溫和高溫脫脂核桃粕中提取核桃蛋白

脫脂核桃粕粉碎，按料液比1∶15（w∶v）加水，用5.0mol/L NaOH溶液調節pH8.0～9.0，50℃浸提1h。離心（4000r/min，20min），去除沉淀。上清液加5.0mol/L HCl調pH至5.0，靜置30min，離心（4000r/min，20min），沉淀用蒸餾水洗兩遍。加入5.0mol/L NaOH溶液調節pH7.0，得上清液，冷凍干燥即為核桃蛋白[4]。

1.3 核桃粕的預處理

1.3.1 超聲波預處理核桃粕 4g高溫或低溫脫脂核桃粕，加入100mL蒸餾水，攪拌器攪拌溶解，超聲波處理15min，溫度為室溫，功率300W。

1.3.2 微波預處理核桃粕 4g高溫或低溫脫脂核桃粕，加入100mL蒸餾水，攪拌器攪拌溶解，微波處理3min，溫度為75℃，功率300W。

1.3.3 水浴加熱預處理核桃粕 4g高溫或低溫脫脂核桃粕，加入100mL蒸餾水，攪拌器攪拌溶解，水浴（90～95℃）條件下加熱10min。

1.3.4 堿提預處理核桃粕 4g高溫或低溫脫脂核桃粕，加入100mL蒸餾水，攪拌器攪拌溶解，采用0.5mol/L NaOH將溶液pH調節至7.5，溶解1h。

1.3.5 50℃堿提預處理核桃粕 4g高溫或低溫脫脂核桃粕，加入100mL蒸餾水，攪拌器攪拌溶解，采用0.5mol/L NaOH將溶液pH調節至7.5，50℃溶解1h。

1.4 核桃肽的制備

1.4.1 由核桃蛋白制備核桃肽 核桃蛋白（2%）用5.0mol/L HCl和5.0mol/L NaOH調到酶解最適pH→加入各種蛋白酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶和風味蛋白酶）→在酶最適作用溫度下水解4h→得到酶解液→離心（4000r/min，20min）→上清液→真空冷凍干燥得到核桃肽（每種酶的酶解條件見表1）。

1.4.2 由核桃粕直接酶解制備核桃肽 4g高溫或低溫脫脂核桃粕→加入100mL蒸餾水攪拌器攪拌溶解→用5.0mol/L HCl或5.0mol/L NaOH調到中性蛋白酶酶解最適pH→在酶最適作用溫度下水解4h→得到酶解液→離心（4000r/min，20min）→上清液→真空冷凍干燥得到核桃肽。

1.4.3 由經過預處理的核桃粕酶解制備核桃肽 經過預處理的核桃粕（4%，w/v）→用5.0mol/L HCl或5.0mol/L NaOH調到中性蛋白酶酶解最適pH→在酶最適作用溫度下水解4h→得到酶解液→離心（4000r/min，20min）→上清液→真空冷凍干燥得到核桃肽。

核桃肽得率以核桃肽凍干粉的重量與酶解前核桃蛋白或核桃粕重量之比來表示。

1.5 核桃肽抗氧化活性的測定

核桃肽的抗氧化活性以核桃肽的總還原能力表示。核桃肽配制成1mg/mL溶液，取樣品液2mL，加入2mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖溶液，再加入2mL、1%的鐵氰化鉀溶液充分混合。混合物于50℃加熱20min后加入2mL TCA（10%），充分混合后離心（4000r/min，10min）。取上清液2mL加入2mL蒸餾水和0.4mL、0.1%的FeCl3，三者充分混合。反應10min后，于700nm下測定混合液吸光值。以蒸餾水作對照，核桃肽的還原能力以（樣品的吸光值—對照的吸光值）表示，吸光值越高，表示其還原能力越強[9]。

1.6 統計分析

實驗結果以方差分析ANOVA來檢測平均值之間的差異，以p＜0.05為差異顯著。統計分析使用OriginPro 7.5軟件。

2 結果與討論

2.1 五種酶酶解核桃蛋白

實驗采用總還原能力方法評價酶解得到核桃肽的抗氧化活性，結果如表2所示。其中，中性蛋白酶酶解核桃蛋白得到核桃肽的總還原能力最強，顯著高于其他四種酶（p＜0.05）；復合蛋白酶酶解得到核桃肽的抗氧化活性也較高（1.02±0.01）；而風味和酸性蛋白酶酶解得到核桃肽的抗氧化活性最低。本研究中由工業用酸性蛋白酶M得到核桃肽的抗氧化活性較低，這一研究結果與用胃蛋白酶酶解核桃蛋白得到核桃肽的研究結果一致[1]，不同的是本研究中是采用總還原力評價肽段的抗氧化活性，而后者采用的是DPPH法。另外，從各蛋白酶酶解核桃肽的得率可以看出中性蛋白酶和復合蛋白酶酶解得到核桃肽的得率也較高，分別為89.00%和87.00%（見表2）。因此，根據不同酶酶解核桃蛋白得到核桃肽的抗氧化活性和得率的結果，選擇中性蛋白酶作為酶制劑進行下一步實驗，考察不同的預處理方式對以低溫或高溫脫脂核桃粕為原料制備核桃肽的得率和抗氧化活性影響。

2.2 不同預處理方式對低溫脫脂核桃粕酶解所得核桃肽的抗氧化活性和得率的影響

低溫脫脂核桃粕為核桃榨油過程中采用冷壓榨工藝得到的副產物，其中的蛋白質仍為未變性狀態。采用水浴加熱、超聲波、微波和堿提等預處理，考察核桃蛋白變性后酶解得到核桃肽的抗氧化活性的差異，結果如圖1所示。從低溫核桃粕中提取核桃蛋白并酶解得到核桃肽的抗氧化活性顯著高于其他以核桃粕為原料制備的核桃肽（p＜0.05）；而經過堿提、微波預處理的核桃粕酶解得到核桃肽的抗氧化活性要顯著高于直接酶解、加熱和超聲波預處理的核桃肽（p＜0.05）。可見，與直接酶解核桃粕相比，本研究選用的堿提和微波預處理可以提高核桃肽的抗氧化活性。

表3為經過不同預處理得到核桃肽的得率，對經過預處理的核桃粕進行酶解，核桃肽得率均高于直接酶解核桃粕的得率。預處理破壞蛋白質的空間結構，使蛋白質結構松散，暴露出更多的酶切位點，進而提高酶解效率，得率明顯增加。

核桃蛋白中谷蛋白為主要成分[3]。谷蛋白的特性為易溶于稀酸或稀堿，因此，在所有的預處理中，經過堿提的預處理操作能提高核桃粕中核桃蛋白的溶解性，使其更易于與溶液的酶分子相互作用，酶解得到的核桃肽無論是抗氧化活性還是得率均較高。從微波和超聲波預處理核桃粕的效果來看，微波加熱對核桃粕的影響較為明顯，抗氧化活性和得率與直接酶解核桃粕相比，明顯增加（見圖1和表3）。目前有關微波與蛋白質的酶解研究多集中在酶解過程中采用微波輔助加熱以縮短酶解時間和能耗上。本研究表明，采用微波對低溫核桃粕進行預處理（300W、75℃、3min）可以顯著提高核桃肽的得率和抗氧化活性。已報道的有關采用超聲波對蛋白質進行預處理的研究中，對燕麥麩皮進行超聲波處理（190W、55℃、28min）顯著提高了燕麥肽的ACE抑制活性[10]；而對燕麥蛋白進行超聲波預處理（50W、20min）時燕麥肽的ACE抑制活性提高，但水解度變化并不明顯[5]。本研究采用的超聲波處理條件是300W、15min、室溫，在該條件下對低溫核桃粕進行預處理，核桃肽的得率和抗氧化活性與直接酶解相比雖有所增加，但效果不如其他的預處理方式。

另外，由低溫核桃粕提取核桃蛋白的提取率為15%～16%，核桃蛋白進行酶解，核桃肽的得率為89%。但由核桃粕提取核桃蛋白須經堿溶、酸沉、離心等工藝。而由核桃粕經過各種預處理酶解得到核桃肽的得率為25.75%～47.3%。可見，工業生產中，與提取核桃蛋白需要的設備和條件相比，直接以經過適當預處理的核桃粕為原料制備核桃肽更符合低成本的需求。

2.3 不同預處理方式對高溫脫脂核桃粕酶解核桃肽的抗氧化活性和得率的影響

不同預處理方式對高溫脫脂核桃粕酶解核桃肽的抗氧化活性影響如圖2所示，核桃粕直接酶解得到核桃肽的抗氧化活性雖然高于堿提和核桃蛋白酶解得到的核桃肽，但相互之間的差異并無顯著性。而超聲波預處理后酶解得到核桃肽的抗氧化活性略低于50℃堿提和微波處理得到的核桃肽，但同樣的并不存在顯著性差異。表3所示的高溫核桃粕經過不同的預處理，核桃肽的得率也相差不多。另外，由高溫核桃粕提取核桃蛋白后再進行酶解得到的核桃肽的得率為82.9%，而圖2的結果顯示，直接酶解核桃粕和提取核桃蛋白后酶解得到核桃肽的抗氧化活性相差不多。因此，雖然由核桃蛋白酶解核桃肽的得率提高，但提取核桃蛋白的工藝過于繁瑣，且高溫核桃粕提取核桃蛋白的得率低（0.63%）。為降低成本，可以直接以高溫核桃粕為原料生產核桃肽。

高溫核桃粕為核桃通過螺旋壓榨的工藝制得，壓榨過程中溫度過高，核桃蛋白變性，使預處理對高溫核桃粕酶解得到核桃肽的抗氧化活性和得率的影響不明顯。另外，高溫核桃粕的顏色為深褐色，酶解出來的核桃肽與低溫核桃粕酶解得到的核桃肽相比顏色較深。

3 結論

本文通過研究發現，對低溫脫脂核桃粕進行預處理可以提高其酶解得到核桃肽的抗氧化活性和得率，其中堿提和微波預處理的效果明顯。但由于提取核桃蛋白的工藝過于繁瑣，工廠生產中為降低成本，可以對核桃粕進行適當預處理后直接酶解。而高溫脫脂核桃粕進行堿提等預處理與直接酶解得到核桃肽的抗氧化活性無明顯差異。本文通過研究不同預處理方式對低溫和高溫脫脂核桃粕酶解得到核桃肽的抗氧化活性和得率的影響，為核桃的深加工提供基礎。

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