采后鈣處理對雙孢菇貯藏生理的影響

孫 婭，李志強，＋，王毓寧，張維敏，李鵬霞，*

（1.江蘇省農業科學院，江蘇南京 210014；2.國家農業科技華東（江蘇）創新中心農產品加工工程技術研究中心，江蘇南京210014；3.南京林業大學森林資源與環境學院，江蘇南京210037）

雙孢菇（Agaricus bisporus）屬于傘菌目、傘菌科、蘑菇屬，因營養豐富和味道鮮美而備受青睞。采收后的雙孢菇由于組織柔嫩，含水量多[1]且菌蓋無明顯保護結構，采后易發生褐變、開傘等變化，嚴重影響其品質和貨架期壽命[2-3]，常溫下僅能保存3～4d[4]。隨著種植面積的擴大和生產數量的增加，雙孢菇的貯藏問題就顯得尤為突出。因此，研究雙孢菇采后貯藏保鮮技術，對延長其運輸時間和貨架期限，提高其采后經濟效益具有重大的意義。采后鈣處理已廣泛地應用于果蔬保鮮中，主要包括蘋果[5]、梨[6]、番茄[7]等；同時鈣處理簡單易行、成本低廉，而Ca2+綠色環保，無毒副作用，因此在生產上具有廣泛的應用前景。適當濃度的鈣能夠維持細胞壁和細胞膜結構與功能的穩定[5，8-9]；降低果實呼吸強度、推遲后熟，減緩果實軟化進程[10]；并能夠提高過氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）等與果蔬抗氧化相關的酶活性[11]，清除自由基減緩衰老。鈣處理在食用菌保鮮方面的研究鮮見報道，主要集中在香菇[12]、金針菇[13]上，對雙孢菇的研究目前尚未見報道。本文作者前期研究了不同濃度（0.5%、1.0%和2.0%）的氯化鈣處理對采后雙孢菇貯藏期間品質的影響，結果發現0.5%CaCl2處理可以有效的抑制呼吸強度、推遲呼吸峰的到來，并能減緩總糖、蛋白質、維生素C、原果膠含量的下降程度，抑制游離氨基酸和可溶性果膠含量的上升，處理效果最好，而高濃度的CaCl2（1.0%和2.0%）對細胞有一定的毒害作用，不利于貯藏保鮮。本文在前期工作的基礎上，研究了不同濃度氯化鈣對雙孢菇采后生理的影響，進一步闡述了氯化鈣對雙孢菇的保鮮作用機制，為雙孢菇貯藏保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雙孢菇（Agaricus bisporus）由江蘇宿遷雙孢菇種植基地提供，采收后分層放置于包裝筐內，以防擠壓和機械傷害，并于2h內迅速運至江蘇省農科院農產品加工所以供實驗，選擇顏色潔白、大小均勻、成熟度一致，無病蟲害和機械損傷的健壯菇作為實驗材料。

UV1102紫外/可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；TGL-18M上海盧湘儀離心機 上海滬粵明科學儀器有限公司；GZX-250BS-Ⅲ光照培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；HH-4恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理實驗 設三個濃度處理：a.0.5%CaCl2（W/V）；b.1.0%CaCl2；c.2.0%CaCl2，清水處理做對照（CK），每個處理設定三個重復；實驗材料去根后，在30min內開始處理，浸泡處理1min，小心撈出瀝干，聚乙烯塑料薄膜包裝以防失水，并貯藏于（溫度0～2℃、相對濕度90%～95%）冷庫中，每2d取樣觀察并測定相關生理指標，共計14d，每個指標重復3次測定。

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 超氧陰離子自由基（O2-）產生速率測定 參照陳建勛和王曉峰[14]的方法。稱取樣品5g，加入10mL 65mmol/L pH7.8的磷酸緩沖液（PBS）研磨過濾，5000r/min離心10min。取上清液1mL，加入65mmol/L PBS 0.9mL，10mmol/L羥胺氯化物0.1mL（以PBS作空白）混合后，于25℃恒溫水浴中培養20min。取上述培養液0.5mL，分別加入17mmol/L對氨基苯磺酸0.5mL，7mmol/L ɑ-萘胺0.5mL，25℃恒溫水浴保溫反應20min。加入1.5mL的正丁醇搖勻后，取正丁醇相測定530nm處的吸光值并根據NO2的標準曲線，計算出O2-的產生速率，單位用nmol/（min·g）表示。其中每個樣品重復三次測定。計算公式：超氧陰離子自由基（O2-）產生速率=（n×V×1000）/（Vs×t×m×蛋白含量）。式中：n：標準曲線查得的超氧陰離子物質的量（μmol）；V：樣品提取液總體積（mL）；Vs：吸取樣品液體積（mL）；t：樣品與羥胺反應時間（min）；m：樣品質量（g）。

1.2.2.2 脂氧合酶（LOX）活性測定 參照Axelrod等[15]的方法并加以改進。取5g樣品置于研缽內，加入10mL 50mmol·L-1PBS（pH7.0）冰浴研磨至勻漿，4℃15000r/min離心15min，上清液用于LOX活性的測定。3mL反應體系中包括亞油酸鈉（100mmol·L-1）25μL，醋酸緩沖液（100mmol·L-1，pH6.0）2.775mL，酶液0.2mL，30℃下反應并于234nm處記錄1min內的吸光值變化，單位用U/（g protein）表示。其中每個樣品重復三次測定。

1.2.2.3 過氧化物酶（POD）活性測定 采用愈創木酚法[16]。樣品（5g）加入10mL預冷的0.05mg·L-1PBS（pH7.0），冰浴研磨，4℃下12000r/min離心20min，所得上清液即為粗酶液；取上述酶液30μL，加入到內含20μL 40mmol·L-1H2O2、2.9mL 50mmol·L-1PBS（pH7.0）、50μL 20mmol·L-1愈創木酚的混合液中反應，對照用30μL 50mmol·L-1PBS（pH7.0）代替酶提取液。測定反應液在470nm處的吸光值，以OD470每分鐘變化0.01光密度值作為一個酶活力單位，單位用U/（g protein）表示。其中每個樣品重復三次測定。

1.2.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 采用氮藍四唑（NBT）法[17]并加以改進。稱取5g樣品，加入10mL 62.5mmol·L-1PBS（pH7.8）冰浴研磨，于13000r/min 4℃離心20min，所得上清液即為酶液。在試管中分別加入3mL反應液（54mL 14.5mmol/L dl-甲硫氨酸中分別加入3μmol/L EDTA、2.25mmol/L NBT、60μmol/L核黃素溶液各2mL）和酶液0.02mL，混合后在光照培養箱內照光（8000lx）10min后立即避光，迅速測定560nm下的吸光值，以單位時間內抑制光化還原50%的NBT為一個酶活力單位，單位用U/（g protein）表示。其中每個樣品重復三次測定。

1.2.2.5 過氧化氫酶（CAT）活性測定 參照曹建康的方法[18]。稱取樣品5g置于研缽中，加入10mL 4℃下預冷的PBS（pH7.0）研磨成勻漿后，轉移并定容至25mL容量瓶。混合均勻后4℃下靜置10min，取上清液4000r/min離心15min，所得上清液即為過氧化氫酶粗提液。反應液包括0.2mL酶液、1.5mL PBS、1mL H2O2，25℃預熱后，逐管加入0.3mL 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定其吸光值，每隔1min讀數1次，共測4min，以1min內OD240減少0.1的酶量為1個酶活單位，單位用U/（g protein）表示。其中每個樣品重復三次測定。

1.2.2.6 多酚氧化酶（PPO）活性測定 參照湯章城[19]的方法。樣品（5g）加入10mL預冷的0.05mg·L-1PBS（pH6.5），冰浴研磨，4℃下12000r/min離心20min，所得上清液即為酶液；在試管中依次加入1mL 0.1mmol/L鄰苯二酚、3.9mL 50mmol/L PBS（pH6.5）、酶液0.1mL，對照用0.1mL 50mmol/L PBS（pH6.5）代替酶液。在30℃下反應2min，測定反應液在525nm處的吸光值，以OD525每分鐘變化0.01光密度值作為一個酶活力單位，單位用U/（g protein）表示。其中每個樣品重復三次測定。

1.2.2.7 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍G-250法[20]。稱取樣品5g放入研缽中，加10mL蒸餾水研磨成勻漿并轉移到離心管中，用6mL蒸餾水分次洗滌研缽，4000r/min離心15min，將上清液轉移并定容至10mL，搖勻待測。以牛血清白蛋白做標準曲線，測定595nm下的吸光值，單位用mg/g表示。其中每個樣品重復三次測定。

1.3 數據統計與分析

所有數據采用SPSS 15.0軟件進行Duncan多重差異比較及相關性分析，當p＜0.05時，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 鈣處理對雙孢菇超氧陰離子自由基（O2-）產生速率的影響

2.2 鈣處理對雙孢菇脂氧合酶（LOX）活性的影響

鈣處理對雙孢菇LOX活性有明顯的影響，且隨著貯藏時間的增加，LOX活性呈下降趨勢（見圖2）。其中，0.5%CaCl2處理下雙孢菇LOX活性下降幅度最大，且在整個貯藏期間均低于對照，14d時為對照的89.27%；1.0%和2.0%的CaCl2處理與對照相比，不能有效地抑制LOX活性，14d時分別高于對照15.74%和36.66%。由此可以看出，0.5%CaCl2處理對雙孢菇貯藏期間LOX活性有很好的抑制作用，能夠減緩雙孢菇的衰老。0.5%與2.0%CaCl2處理之間有顯著差異（p＜0.05），而與對照和1.0%CaCl2處理之間差異不顯著（p＞0.05）。

2.3 鈣處理對雙孢菇過氧化物酶（POD）活性的影響

如圖3所示，與0d相比，不同處理下雙孢菇POD活性呈現整體下降的趨勢。其中0.5%CaCl2處理在第4d時POD活性為對照的1.68倍，比對照出現第一次最大值時提前了2d，隨后下降又上升至第10d達到對照的1.97倍，14d時為對照的144.87%；1.0%CaCl2處理在第6d達到對照的1.09倍，隨后下降，14d時達到對照的115.23%；2.0%CaCl2處理在第6d時POD活性低于對照0.71%，在10d達到對照的1.35倍，14d時為對照的87.13%。以上可知，0.5%和1.0%CaCl2處理能夠迅速地提高POD活性，從而消除過氧化物，降低活性氧的傷害，進而維持雙孢菇的貯藏品質，其中0.5%CaCl2處理效果最好。0.5%與1.0%CaCl2處理之間無顯著差異（p＞0.05），而與對照和2.0%CaCl2處理之間差異顯著（p＜0.05）。

2.4 鈣處理對雙孢菇超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖4可以看出，不同處理下雙孢菇的SOD活性在貯藏過程中隨著時間的延長呈現上升趨勢。其中0.5%CaCl2處理在整個貯藏期間SOD活性均高于對照，14d時為對照的106.45%；1.0%CaCl2處理在第14d達到對照的97.72%，僅在12d處高于對照3.83%，其余時間SOD活性低于對照；2.0%CaCl2處理在整個貯藏期間均低于對照，14d時為對照的90.41%。由此可以看出，0.5%CaCl2處理更有利于保持雙孢菇較高的SOD活性，減少活性氧對其的傷害，延緩雙孢菇衰老。其中各處理之間無顯著差異（p＞0.05）。

2.5 鈣處理對雙孢菇過氧化氫酶（CAT）活性的影響

隨著貯藏時間的延長，不同處理下雙孢菇的CAT活性呈現總體上升趨勢（見圖5）。0.5%CaCl2處理在整個貯藏期間CAT活性均高于對照，且在4d時高于對照2.90%，在第14d時為對照的102.19%；1.0%CaCl2處理在第6d時CAT活性高于對照2.25%，比對照出現第一次最大值時推遲了2d，其余時間均低于對照，14d時為對照的97.81%；2.0%CaCl2處理下CAT活性在整個貯藏期間均低于對照，且在第14d時為對照的87.98%，各處理在整個貯藏期間和對照相比差異不顯著（p＞0.05）。由以上分析可知，0.5%CaCl2處理在貯藏期間增長幅度最大，且在貯藏期間均高于對照，說明0.5%CaCl2處理能使CAT活性維持在較高水平，進而清除H2O2的積累，有利于維持雙孢菇細胞內自由基代謝的穩定性。

2.6 鈣處理對雙孢菇多酚氧化酶（PPO）活性的影響

從圖6可以看出，雙孢菇在貯藏期間PPO活性呈現下降趨勢。0.5%CaCl2處理下降幅度最大，且在14d內均低于對照；1.0%CaCl2處理也能夠在一定程度上降低PPO的活性，但在第4d和第8d均高于對照5.76%和52.34%，第14d時為對照的85.52%；2.0%CaCl2處理不能有效減少PPO的活性，在第14d高于對照9.83%。以上分析表明，0.5%和1.0%CaCl2處理均能降低雙孢菇中PPO的活性，但0.5%CaCl2處理效果更好。其中對照與0.5%CaCl2處理之間有顯著差異（p＜0.05），而與1.0%和2.0%CaCl2處理之間差異不顯著（p＞0.05）。

3 討論

3.1 鈣處理對雙孢菇O2-產生速率的影響

超氧陰離子（O2-）可直接作用于蛋白而進一步轉化為對細胞核結構有破壞作用的活性氧，因此O2-的生成速率可以反映出植物細胞受損情況。徐炯達等研究[21]發現，熱處理和鈣處理均能明顯地降低蘋果梨果實貯藏期間O2-的生成速率。從實驗中可以看出，0.5%的氯化鈣處理能夠有效地抑制雙孢菇中O2-的產生速率，維持活性氧代謝，保護細胞膜結構，進而延緩雙孢菇的衰老。

3.2 鈣處理對雙孢菇LOX酶活性的影響

脂氧合酶（LOX）在果實成熟和衰老過程中起著十分重要的作用。它以亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸為底物，啟動膜脂過氧化，產生過氧自由基，進而破壞細胞膜結構，最終引起細胞的衰老和死亡。史蘭等[22]發現0.5%CaCl2處理降低了冬棗LOX活性，延緩了冬棗的衰老過程。本研究中發現低濃度的鈣處理（0.5%）對雙孢菇LOX活性有很好的抑制作用，能夠延緩雙孢菇的衰老。

3.3 鈣處理對雙孢菇抗氧化酶（POD、SOD、CAT）活性的影響

過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）是一類普遍存在于植物中的抗氧化酶，其活性與植物的代謝及抗衰老能力有密切關系。其中POD能夠催化植物組織中低濃度的H2O2氧化其他底物，從而清除H2O2，降低其對植物組織的毒害；SOD屬于一類含不同金屬離子的氧化還原酶，它能夠清除組織代謝產生的活性氧，防止O2-的毒害作用，從而保護細胞膜結構和功能的完整性；CAT可以分解植物體內高濃度的H2O2，清除活性氧的傷害。實驗結果表明，鈣處理可以通過提高POD、SOD、CAT的活性，防止活性氧的積累，進而延緩雙孢菇的衰老，延長運輸和貨架期限，這與王煒等[5]研究結論一致。綜合分析表明，0.5%CaCl2處理與其他濃度相比效果最好，能夠快速地提高雙孢菇POD、SOD、CAT的活性，維持細胞內自由基代謝的穩定性，其中1.0%CaCl2處理能夠提高雙孢菇POD的活性，維持雙孢菇的品質。

3.4 鈣處理對雙孢菇褐變過程中關鍵酶（PPO）活性的影響

雙孢菇的褐變主要由酶促反應引起，在有O2條件下，多酚氧化酶（PPO）能將無色酚類化合物氧化成紅褐色的醌，醌再進一步與氨基酸反應生成“類黑色聚合物”，從而導致雙孢菇褐變，影響其品質。有研究表明，3%鈣處理能夠降低冷藏期間桃PPO的活性[23]，同時本實驗結果表明，0.5%和1.0%CaCl2處理均能降低雙孢菇貯藏期間PPO的活性，抑制貯藏過程中雙孢菇的褐變，但0.5%CaCl2處理效果更好。

4 結論

研究發現，0.5%濃度的氯化鈣處理能夠有效的抑制O2-和LOX的產生、提高POD、SOD、CAT的活性，減少植物組織中PPO的產生，這可能是由于適當濃度的鈣能夠維持細胞結構，保護細胞膜的完整性，進而保持防御系統中酶的活性；同時使細胞清除活性氧自由基的能力增強，減少自由基對膜系統的損傷，延緩雙孢菇的衰老過程[24]。1.0%CaCl2處理能提高POD的活性和降低PPO的活性，但對其他生理指標效果不明顯；2.0%CaCl2處理效果不好，不能延緩雙孢菇的衰老。由此可以看出，高濃度的CaCl2對細胞有一定的毒害作用，會造成雙孢菇生理混亂，導致貯藏保鮮效果不理想。同時，據本文作者的前期研究結果表明0.5%CaCl2處理可以有效的抑制呼吸強度、推遲呼吸峰的到來，并能減緩總糖、蛋白質、維生素C、原果膠含量的下降程度，抑制游離氨基酸和可溶性果膠含量的上升；1%CaCl2處理能夠推遲呼吸峰的產生時間，在貯藏后期（12～14d）抑制蛋白質含量的下降且0～4d時VC含量也高于對照；2%CaCl2處理下0～8d內總糖含量較高，12～14d時蛋白質含量高于對照。兩者的研究結果較為一致。綜合考慮，0.5%CaCl2處理可用于雙孢菇的貯藏保鮮并在生產中具有推廣價值。

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