羊棲菜急性毒性實驗及體外抑菌活性的研究

錢媛華，楊靖亞，孫立春，王燕萍，王 珍

（上海海洋大學海洋科學研究院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306）

羊棲菜[Sargassum fusiforme（Harv.） Setchel]屬褐藻門馬尾藻科，藻體黃褐色，多分布于我國沿海，素有“長壽菜”、“餐桌上的海人參”之美譽，在中國古代，人們有用海藻羊棲菜入藥的習慣，南齊陶弘景的《神農本草經》[1]及李時珍的《本草綱目》[2]均有記載。現代研究也表明羊棲菜具有降血壓、降血脂、抑菌、消除放射性物質危害、防癌抗癌和減肥美容等功效[3-5]。羊棲菜水提物的成分比較復雜，但現已基本確定其有效成分主要是羊棲菜多糖（Sargassum FusifomePolysaccharides，SFPs），一種水溶性多糖，主要以褐藻酸、褐藻糖膠和褐藻淀粉的形式存在，具有復雜的多方面的生物活性與功能特點，且為非細胞毒性物質，其中，硫酸根的含量與多糖的生物活性具有密切關系[6-7]。雖然羊棲菜有極高的食用和藥用價值，但由于其特殊的砷富集作用（世界衛生組織下屬國際癌癥研究組織已把砷列為致癌物），使得其全藻中砷含量嚴重超標，讓很多國家和地區對其敬而遠之。到目前為止，尚未有對羊棲菜全藻及水提物的可食用性及抑菌活性進行的報道。針對沿海地區人們熱衷于食用羊棲菜全藻，以及國內市場上出現的以羊棲菜水提物為主料的保健飲料，本實驗定量檢測了羊棲菜全組分及水提物中多糖、硫酸根、總砷及無機砷含量，對羊棲菜的急性毒性及體外抑菌活性進行了考察，為探究羊棲菜的食用安全性及開發利用性提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊棲菜 購自浙江洞頭農業科技發展有限公司；實驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，由上海復旦大學提供，合格證號SCXK（滬）2009-0019；變異鏈球菌 四川大學華西口腔醫學院齲病研究室惠贈；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌 上海海洋大學食品學院微生物培養室；腦心浸液（BHI）液體/固體培養基 購自北京陸橋技術有限責任公司；營養瓊脂培養基（NA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）、胰蛋白大豆瓊脂培養基（TSA） 購自上海康潤生物科技有限公司；濃鹽酸、明膠、氯化鋇、硫酸鉀、三氯乙酸、苯酚、濃硫酸、葡萄糖等試劑 均為分析純。

HWS-24雙列四孔恒溫水浴鍋 上海慧泰儀器制造有限公司；JA1003B光電分析天平 上海越平科學儀器有限公司；DHG-9140A烘箱 上海慧泰儀器制造有限公司；TGL-20C冷凍離心機 上海圣科儀器設備有限公司；UV1102PC紫外可見分光光度計 上海天美科學儀器；DHG-9140A數顯電熱恒溫鼓風干燥箱 上海慧泰儀器制造有限公司；BPH-9082精密恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羊棲菜樣品制備[8]干羊棲菜預處理→消化→勻漿→羊棲菜全藻組分（每毫升全藻組分含0.1g干羊棲菜，即0.1g/mL）

干羊棲菜預處理→熱水浸提→冷卻→過濾→離心→濃縮→羊棲菜水提液（每毫升水提液含1g干羊棲菜，即1g/mL）

工藝說明：a.羊棲菜預處理：自來水浸泡過夜，洗凈，切小段。b.消化：加入5‰ Na2CO3即純堿，90℃、消化6h。c.勻漿：組織勻漿機勻漿得全藻組分。d.熱水浸提、離心：熱水浸提兩次，100℃水浴2h，400目濾網過濾，合并濾液，離心得上清，濃縮后即為羊棲菜水提液。

1.2.2 羊棲菜樣品中相關成分檢測方法

1.2.2.1 苯酚-硫酸法測定多糖濃度[9]繪制標準曲線：配制葡萄糖標準溶液（40μg/mL），分別吸取葡萄糖標準溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，各以水補至2.0mL，然后加入6%苯酚1.0mL及濃硫酸5.0mL，靜置10min后搖勻，室溫放置20min后于490nm測定吸光度。以2.0mL水按同樣方法操作，作為空白，以多糖微克數為橫坐標，光密度值為縱坐標，制作標準曲線，得回歸方程為y=0.0089x，R2=0.996。

樣品多糖含量測定：吸取樣品液1.0mL，按上述步驟操作，測光密度，以標準曲線計算羊棲菜水提液、全藻組分中多糖含量。

1.2.2.2 硫酸基的氯化鋇-比濁法測定硫酸根含量[10]

標準曲線的制備：精確吸取0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mL標準硫酸基溶液于具塞試管中，標記為0、1、2、3、4、5、6管，各管以lmol/L HCI溶液補加總體積至0.2mL。另加入3.8mL 3%三氯乙酸和lmL氯化鋇-明膠溶液，混合，室溫靜置15min，于分光光度計上測定360nm處測光密度值，以0管作對照得A1。另用同樣標準溶液系列，唯以明膠試液代替氯化鋇一明膠溶液，于分光光度計上測定360nm處測光密度值，以0管作對照得A2。以硫酸基微克數為橫坐標，縱坐標為吸光度（A1-A2），作標準曲線，得回歸方程為：y=0.0008x，R2=0.995。

樣品含量測定：以lmol/L HCl作溶劑配制適量濃度的樣品液，封閉管在100℃加熱3h，冷卻后吸取0.2mL進行分析，按上法測光密度值，對照標準曲線計算硫酸基含量。

1.2.2.3 總砷及無機砷的測定 根據GB/T 5009.11-2003《食品中總砷及無機砷的測定》。

1.2.3 羊棲菜樣品對小鼠的急性毒性實驗 參照經典的急性毒性實驗方法，進行羊棲菜全組分、水提液的急性毒性實驗[11-13]。

1.2.3.1 預實驗 在進行正式實驗之前，首先做預實驗以便為正式實驗提供依據。若死亡率≥30%，則測定半數致死量（LD50）；如不足以引起死亡，則采用最大灌胃量測定。小鼠12只，隨機分為3組（全組分組、水提組、對照組），雌雄各半，灌胃前禁食不禁水12h。給藥組給以可供灌胃的最大濃度（全組分0.1g/mL、水提液1g/mL）、小鼠灌胃可承受的最大體積（0.8mL/20g）一次灌胃給藥，給藥后常規飼養，連續觀察7d。對照組給予等量蒸餾水。結果小鼠全部存活，灌胃給藥無法測出本品的半數致死量（LD50），提示該藥是較安全的。

1.2.3.2 正式實驗 根據預實驗結果，進行小鼠最大給藥量的實驗。昆明種鼠60只，隨機分為三大組：全組分組、水提組、對照組，每組20只，雌雄各半。日內3次灌胃，以最大給藥濃度、最大灌胃體積進行灌胃，連續觀察7d，詳細記錄小鼠的體重、活動、飲食、毛發、大小便及死亡情況。計算出總給藥量，并推算出相當于臨床用藥量的倍數，以耐受成人用量口服100倍以上為安全。計算方法：

小鼠最大給藥量（g/kg，系折合生藥量計算）=每日小鼠灌胃量（mL/kg）×藥物濃度（g/mL）×每克樣品的生藥量（g/g）；

小鼠最大耐受量倍數=每只小鼠的耐受量（g/kg）/小鼠平均體重（kg）×成人平均體重（g/kg）/成人每天用量（kg）；

小鼠總砷最大給藥量（μg/kg）=小鼠最大灌胃量（mL/kg）×樣品總砷含量（μg/mL）；

小鼠無機砷最大給藥量（μg/kg）=小鼠最大灌胃量（mL/kg）×樣品無機砷含量（μg/mL）。

表1 羊棲菜樣品中多糖、硫酸根、總砷及無機砷含量（）Table 1 The contentof polysaccharides，sulfuric radical，total arsenic and inorganic arsenic in Sargassum fusiforme samples（）

樣品 多糖（mg/mL） 硫酸根（mg/mL） 總砷含量（μg/mL） 無機砷含量（μg/mL）全組分（0.1g生藥量/mL） 11.5 0.534 1.2 1.0水提組分（1g生藥量/mL） 14.5 2.9 4.4 3.6

1.2.4 羊棲菜樣品的抑菌性實驗

1.2.4.1 細菌的培養及菌液制備 將-80℃保存的金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌、大腸桿菌復蘇后分別接種于TSA固體培養基、營養瓊脂培養基、BHI固體培養基，一定條件下37℃培養24h，涂片鏡檢后挑單菌落分別接種于TSB液體培養基、TSB液體培養基、BHI液體培養基，一定條件下37℃培養24h，收集菌液，調節菌濃度為1.8×l04CFU/m L。

1.2.4.2 樣品對三種細菌最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定[14]采用液體稀釋法測定最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），具體方法為：在96孔板中羊棲菜全藻組分從25mg/m L濃度開始進行二倍稀釋，序列中水提液最低濃度為0.2mg/m L；羊棲菜水提液從250mg/m L濃度開始進行二倍稀釋，序列中水提液最低濃度為2.0mg/m L。每孔樣品液和菌液各100μL，37℃培養48h，肉眼觀察無細菌生長的樣品液最低濃度為MIC。同時設陰性對照和陽性對照，陰性對照組為樣品液和液體培養基各100μL，其樣品藥物濃度對應實驗組樣品藥物濃度；陽性對照組為相應液體培養基和菌液各100μL。每個濃度設4個平行孔。取肉眼觀察清亮的實驗組孔中的液體，劃線接種于相應固體培養基平板，37℃培養48h，無細菌生長的最低藥物濃度為最低殺菌濃度（minimal bactericidalconcentration，MBC）。

1.2.5 實驗數據統計方法 統計分析：所有的數據用均數或均數±標準差表示，數據采用Independent Samples t Test，統計軟件用SPSS 18.0，p＜0.05表示差別有統計學意義，p＜0.01表示差別有顯著統計學意義。

2 結果與分析

2.1 羊棲菜樣品中多糖、硫酸根、總砷及無機砷含量

干羊棲菜全藻的基本成分為：蛋白質12.05%、碳水化合物60.71%、脂肪0.45%、灰分12.47%、水分含量14.32%[15]。羊棲菜水提物的成分比較復雜，但現已基本確定其有效成分主要是羊棲菜多糖。由表1可知，全組分中多糖得率為11.5%，硫酸根占多糖含量的4.6%。水提物多糖得率為1.45%，硫酸根占多糖含量的20%。羊棲菜全組分及水提物中無機砷含量都超過了GB 19643-2005《藻類制品衛生標準》中關于藻類中無機砷（干重計）≦1.5mg/kg的限量標準（這個標準是根據砷的毒性和人體藻類可能攝入量來定的），且無機砷含量均占總砷含量的80%以上。顧晶晶等[16]報道LD50與無機砷呈負相關關系，即無機砷含量越高毒性越大，相比較與總砷含量的相關性較差。

2.2 羊棲菜水提液、全組分對小鼠急性毒性實驗結果

2.2.1 一般情況 由表2可以看出，小鼠按最大容量于1d內灌胃給予最大限度的樣品后，連續觀察7d，所有受試小鼠毛色光潔，飲食、活動和二便正常，鼻、眼、口腔無異常分泌物，未出現不良情況和死亡情況。

2.2.2 體重變化 由表3可以看出，給藥組與對照組小鼠體重在給藥后7d均增加，但給藥組與對照組比較無顯著性差異（p＞0.05）。

表3 羊棲菜樣品最大給藥量實驗對小鼠體重的影響（±SD）Table 3 The change ofmice body weightunder the maximum dose of the Sargassum fusiforme samples（±SD）

注：給藥組與對照組比較無顯著性差異（p＞0.05）。

組別 給藥前體重（g）給藥后體重（g）體重前后變化（g）全組分組 19.24±1.14 21.54±1.30 2.3±0.62水提組 19.11±1.16 21.75±1.37 2.64±0.73對照組 18.51±0.84 20.63±1.08 2.12±0.38

2.2.3 臟器觀察 對三組小鼠進行大體解剖，觀察心、肝、脾、肺、腎、胃腸等主要臟器，均未見組織有異常改變。

2.2.4 結果計算 羊棲菜全組分組小鼠最大給藥量為12g生藥量/kg·BW，表明小鼠對羊棲菜全藻組分組的耐受量至少為12g生藥量/kg·BW，相當于成人擬定日食用干羊棲菜量（5g/d）的120倍；折算成小鼠總砷最大給藥量144μg/kg，相當于成人每日總砷允許攝入量（WHO：暫定總砷攝入的安全標準為每日50μg/kg·BW）的2.9倍；折算成小鼠無機砷最大給藥量120μg/kg，相當于成人每日無機砷允許攝入量（WHO：暫定無機砷攝入的安全標準為每日2.1ug/kg BW）的57.1倍。

羊棲菜水提組小鼠最大給藥量為120g生藥量/kg BW，表明小鼠對羊棲菜水提液的耐受量至少為120g生藥量/kg·BW，相當于50kg成人擬定日食用干羊棲菜量的1200倍；折算成小鼠總砷最大給藥量528μg/kg，相當于成人每日總砷允許攝入量的10.6倍；折算成小鼠無機砷最大給藥量432μg/kg，相當于成人每日無機砷允許攝入量的206倍。

2.3 羊棲菜樣品對三種細菌最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定結果

實驗結果顯示，羊棲菜全組分對金黃色葡萄球菌的MIC為125mg/m L，MBC為250mg/m L；羊棲菜水提液對金黃色葡萄球菌的MIC、MBC均為125mg/m L。羊棲菜全組分及水提液對大腸桿菌、變異鏈球菌均未觀察到抑菌作用。

3 結論與討論

實驗首先證實了羊棲菜全藻樣品及水提樣品中無機砷含量超標，但在隨后進行的羊棲菜全藻樣品及水提樣品對小鼠的急性毒性實驗中，并沒有觀察到有相應的砷中毒現象發生，理論上可初步判定羊棲菜全藻樣品及水提樣品毒性較低，可食用性較好。這種現象，一方面原因可能是羊棲菜樣品中豐富的多糖除具有吸收脂肪和膽固醇的作用外，對重金屬和放射性元素亦具有阻吸作用[17]，或者是羊棲菜本身含有的某些其他成分在體內對砷的毒性有抵抗作用，這就有待于后期的進一步探索。另一方面，關于毒性的概念，不能停留在急性毒性的認識上，毒性與劑量、接觸途徑、接觸期限等都有密切關系，所以評價毒性，不能僅以急性毒性高低來表示，針對有一些有害物質的急性毒性是屬于低毒或微毒，但卻有蓄積毒性、亞急性、亞慢性毒性、致畸毒性、生殖毒性、致癌性等其他毒性，而這些毒性對人類的健康造成的傷害是巨大的。故關于羊棲菜的食用安全性研究，還應該結合長期毒性實驗的毒性表現及多種檢測結果綜合分析評價其毒性。

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