人臍帶間充質干細胞移植對小型豬急性心肌梗死模型心肌細胞再生的影響

張 嵬，楊 力，張亞東，李 婷，陳 越，劉曉程

(天津醫科大學心血管病臨床學院泰達國際心血管病醫院，天津 300457)

冠狀動脈介入與搭橋術是目前心肌血運重建的主流方法。對于心肌梗死患者，二者能明顯改善心肌血供，但無法恢復具有有效收縮功能的心肌細胞數量，亦無法改善心室重構和心力衰竭。近10年來，骨髓間充質干細胞移植用于心肌梗死治療的研究取得了較大進展，但也發現了這一方法的弊端。臍帶間充質干細胞是一種具有自我更新、增殖及多向分化潛能的干細胞，其取材方便、來源廣泛、數量充足、免疫原性低、可避免倫理爭議，且增殖速度快、分化能力強，應用前景廣泛［1］。研究發現，臍帶間充質干細胞在體外藥物干預后可向心肌細胞分化［2，3］，且在心肌梗死的小動物模型中具有促進心血管組織再生和修復的作用［4，5］。2012 年 3 ～12月，我們觀察了人臍帶間充質干細胞移植對小型豬急性心肌梗死模型心肌細胞再生的影響，旨在為其臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 CM-Dil(美國 Invitrogen公司);c-TnT鼠抗人單克隆抗體，c-kit鼠抗人單克隆抗體與兔抗人單克隆抗體(美國Lab Vision＆NEOMARKERS公司);vWF兔抗人多克隆抗體(英國Abcam公司);Masson三色法染色試劑盒(福州邁新生物技術有限公司);TUNEL試劑盒(德國Roche公司);廣西巴馬小型豬(上海甲干生物科技有限公司);經圖像分析軟件 Image Pro Plus 6.0(美國 Media Cybernetics公司);麻醉機(Detax-Ohmeda 700，美國);心電監護儀(Detax-Ohmeda 700，美國);激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(日本Nikon公司)

1.2 實驗方法

1.2.1 臍帶間充質干細胞制備 無菌條件下采集臍帶標本并剪成1 mm3左右大小的組織塊，應用組織塊爬片法分離臍帶間充質干細胞并成功傳代擴增至第5代達108數量級，流式細胞儀檢測細胞表型，實驗前采用CM-Dil標記。

1.2.2 急性心肌梗死模型制作及干預 23只廣西巴馬小型豬(體質量20～25 kg)經肌注鹽酸賽拉嗪3 mg/kg與靜注丙泊酚20 mg誘導麻醉。氣管插管，呼吸機輔助通氣，潮氣量350 mL，15次/min，氧流量1 L/min。術中1% ～2%異氟烷吸入、丙泊酚2 mg/(kg·h)靜脈持續泵入維持麻醉，持續心電監護。胸骨正中切口暴露心臟，缺血預適應3次后(5 min/次)結扎冠狀動脈前降支中、遠端1/3交界處。7只結扎冠狀動脈后出現室顫，予電除顫后2只存活，5只死亡。心電圖及核素心肌灌注顯像確定18只心肌梗死模型制作成功。將18只造模豬隨機分為對照組、PBS組和移植組，每組6只。移植組釆用微量注射器將備好的標記CM-Dil的臍帶間充質干細胞懸液(2 mL，1×107細胞/mL)經心外膜呈矩陣分布多點注入梗死組織(每點注入0.2 mL)。PBS組以同樣方法注入等量PBS。對照組只造模不干預。術后3組均肌注青霉素160萬U，2次/d，連續3 d。

1.2.3 觀察項目

1.2.3.1 心肌灌注情況 模型建立后即刻和干預后6周行梗死區心肌灌注核素顯像:耳緣靜脈注射14.8 MBq/kg 99m锝—甲氧基異丁基異腈，給藥30 min后行心電門控心肌灌注核素顯像。儀器為GE Millennium VG-5，配低能通用型準直器，2個探頭呈90°夾角，繞心臟旋轉 180°，每幀釆集 25 s，共釆集30幀，矩陣64×64，放大倍數2.0，釆用濾波反投影重建原始圖像。通過Emory Cardiac Toolbox軟件量化灌注質量缺損百分率(MDP)及左室射血分數(LVEF)。以治療后與治療前灌注質量缺損百分率的差值 (ΔMDP)評價灌注情況，LVEF的差值(ΔLVEF)評價心臟功能。

1.2.3.2 干細胞存活、分化及增殖情況 采用免疫熒光技術分析。術后6周靜脈注射1 g KCl處死動物，取心肌梗死及交界區組織，制作冰凍切片。采用熒光顯微鏡觀察所標記的熒光細胞(即干細胞)。組織切片分別以c-kit、c-TnT、vWF抗體作為一抗標記，采用FITC標記的抗兔二抗和Cy5標記的抗小鼠二抗對切片進行復染。采用IPP圖像處理軟件對圖像進行疊加分析。

1.2.3.3 心肌細胞存活與凋亡情況 術后6周靜脈注射1 g KCl處死動物，取心肌梗死及交界區組織，福爾馬林固定后行石蠟切片。以Masson三色法檢測存活心肌，以TUNEL法檢測細胞凋亡情況。采用IPP圖像處理軟件對圖像進行分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。數據以表示。采用多個樣本單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌灌注情況 移植組、對照組、PBS組ΔMDP分別為 -0.83% ±1.17%、4.33% ±1.86%、3.67% ±1.21%。移植組低于對照組及PBS組(P均＜0.01)。移植組、對照組、PBS組 ΔLVEF分別為1.00% ±3.22%、-9.17 ±2.48%、-9.33 ±2.73%，移植組低于對照組及PBS組(P均＜0.01)。

2.2 干細胞存活、分化及增殖情況 移植6周后移植組梗死交界區域內可見CM-Dil陽性細胞。c-TnT與vWF染色中部分細胞呈陽性。除外源性植入的臍帶間充質干細胞外，梗死區域內尚發現CM-Dil陰性而c-kit染色呈陽性的細胞，部分細胞c-TnT與vWF染色亦呈陽性。

2.3 心肌細胞存活與凋亡情況 Masson三色法染色結果應用IPP軟件量化分析，移植組、對照組、PBS組心肌細胞存活量分別為(31391±4794)、(31520±4164)、(72271 ±4844)IOD/hpf。移植組明顯多于對照組及PBS組，P均＜0.01;即移植組交界區域存活心肌細胞明顯增多，對應的纖維組織明顯減少。TUNEL染色結果發現移植組心肌細胞凋亡數為(40±4)個cell/hpf，明顯少于對照組和PBS組的(82±5)和(79±5)個 cell/hpf，P均 ＜0.01。

3 討論

雖然冠狀動脈介入與搭橋術對急性心梗的治療效果良好，但術后常出現病理性心室重塑進而引發心力衰竭，且迄今沒有有效的治療措施，甚至需通過器官移植才能恢復心臟功能［6，7］。分析其原因，主要是具有收縮功能的心肌細胞與營養心肌細胞的冠脈循環絕對不足。目前研究的目標是找到適宜方法以替代心肌梗死細胞，預防或逆轉病理性心臟重塑。心血管再生醫學與干細胞療法成為當前最具吸引力和前途的方法［8］。

間充質干細胞是中胚層來源的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞，廣泛存在于全身多種組織中。骨髓間充質干細胞是最早被分離出并被廣泛用于治療缺血性心臟病研究的成體干細胞。多項臨床前的大動物實驗研究均證實骨髓間充質干細胞能夠成功植入并分化為心肌和血管內皮細胞［9～12］;亦能激活心肌干細胞生成新的心肌與血管結構［13，14］。但隨著年齡增長，骨髓干細胞功能及生長、分化能力降低，端粒明顯變短［15］;加上抽吸骨髓為有創性操作、骨髓供體有限，均限制了同種異體骨髓干細胞的應用［16］。相對于骨髓干細胞，臍帶間充質干細胞具有取材簡便、組織來源豐富、細胞原始、增殖能力強、分化潛能大、免疫原性低、不誘發畸胎瘤、無病毒感染風險及倫理問題等優點，是骨髓間充質干細胞的理想替代物［1］。

何紅燕等［3］將用BrdU標記的人臍帶間充質干細胞移植至心肌梗死的大鼠心肌，2周后發現，移植細胞仍存活，且能表達心肌細胞標記物心臟肌鈣蛋白I和T。Wu等［4］在體外試驗和大鼠心梗模型中再次證實了臍帶間充質干細胞能向心肌細胞分化，超聲提示移植后2周和4周的左室功能較對照組改善。Latifpour等［5］觀察到，結扎 LAD 后30 d，接受人臍帶間充質干細胞治療的家兔的左室射血分數和短軸縮短率明顯改善，瘢痕含量顯著減低;組織病理學分析顯示，鄰近和遠離梗死區域的植入細胞表達肌鈣蛋白I、actin和connexin-43，在梗死區內亦可見少數移植的細胞。

本研究結果顯示，臍帶間充質干細胞植入小型豬急性梗死心肌后6周仍然存活，其中部分干細胞分化為心肌細胞和血管內皮細胞。與其他兩組相比，移植組心肌缺血區域內亦存在較多的CM-Dil陰性、c-kit陽性的心肌干細胞(CSCs)。在外源性干細胞的刺激下，CSCs在缺血區域募集并部分分化為新生的心肌細胞與血管內皮細胞，證實臍帶間充質干細胞可能通過外源性和內源性再生兩個方面的機制參與心梗后損傷的修復，新生的心肌細胞可部分取代梗死細胞而發揮組織修復功能。

研究證實，間充質干細胞的旁分泌機制對心梗后損傷的修復亦具有重要作用。有學者對臍帶和骨髓間充質干細胞的生長因子分泌譜進行了比較，發現臍帶間充質干細胞可更強地表達數種直接或間接地與血管生成有關的生長因子，如血管內皮生長因子-D(VEGF-D)、血小板衍生的生長因子(PDGFAA)、轉化生長因子-β2(TGF-β2)、堿性成纖維生長因子(bFGF)和肝細胞生長因子(HGF)［17］。提示臍帶間充質干細胞可能更適用于治療缺血性病變。鑒于HGF和bFGF被報道具有抗纖維化的作用［18］，因此提示臍帶間充質干細胞可用于預防或減輕纖維化。本研究結果亦證實了上述觀點。

本研究結果提示，人臍帶間充質干細胞經體外培養擴增后經心外膜直接注射植入，可在小型豬心梗模型的心肌梗死區域部分存活并分化為心肌和血管組織;人臍帶間充質干細胞可促進固有心肌干細胞的募集和分化，減少細胞凋亡和組織纖維化，抑制心室重塑的發生，改善梗死區域的心肌灌注和心室功能。

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