水飛薊素膠囊溶出度一致性評價研究

花逾冬 劉延龍 劉娟

(1.上海市生物醫(yī)藥科技產(chǎn)業(yè)促進(jìn)中心 上海 201203；2.上海世康特制藥有限公司 上海 201809 )

水飛薊素（silymarin，1）具有阻止或抑制脂質(zhì)過氧化，穩(wěn)定肝細(xì)胞膜，改善肝功能的作用，對急慢性肝炎、肝硬化和代謝中毒性肝損傷具有較好的療效。1為水難溶性藥物，用普通方法制備口服制劑，生物利用度較低。采用固體分散體等制劑工藝以期提高溶出度和生物利用度的研究有不少報道[1-4]。多種pH溶出介質(zhì)中的溶出曲線對比已成為對口服制劑質(zhì)量一致性和體內(nèi)生物等效性評估的重要手段[5-7]。本文以市售1膠囊（利加隆）作為參比藥物，同時與1原料藥和市售益肝靈片作比較，考察以固體分散原理自制的試制品1膠囊的溶出度并作一致性評價研究。

按照USP和進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)，將1含有的6種組份作為溶出度考察對象，并按以下方法組合進(jìn)行計(jì)算：水飛薊賓（sylibin，2）其中含水飛薊賓A和水飛薊賓B（sylibin A + sylibin B）；異水飛薊賓（isosylibin，3）其中含異水飛薊賓A和異水飛薊賓B（isosylibin A + isosylibin B）；水飛薊汀和水飛薊濘（sylichristin +sylidianin，4）。上述各異構(gòu)體組份含量之和為1含量。

1 儀器與試藥

ZRS-8G智能溶出試驗(yàn)儀(天津天大天發(fā)科技有限公司），Agilent1200高效液相色譜儀， MP1100B型電子分析天平。

2對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110856-200604），3、4對照品（上海同田生物技術(shù)有限公司，批號分別為09121523和09121521）；1膠囊（利加隆）（規(guī)格:140 mg/粒，德國馬博士大藥廠，批號B0802693）；市售益肝靈片（ 規(guī)格：38.5 mg/片，上海復(fù)興朝輝藥業(yè)有限公司，批號1103F030）；試制品1膠囊（含量：143 mg/粒，批號110301）；1原料藥（遼寧省盤錦華成藥業(yè)有限公司，含量：80.2%，粒度：過100目28.7%、80目至00目61.6%、80目以下9.7%，比表面積：0.375 m2/g，批號20090804）；水為超純水；甲醇（色譜純）；其他試劑均為分析純。1的理化性質(zhì)[8]：1在水中的溶解度為0.040 1 mg/ml。由丙酮加石油醚所得水飛薊賓，為含1分子水之晶體，mp 167 ℃，180 ℃分解。水飛薊賓溶于丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇，微溶于氯仿，不溶于水。

2 方法與結(jié)果

2.1 各組份定量方法及驗(yàn)證

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，（4.6 mm×125 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流動相：混合溶劑A[85%磷酸-甲醇-水（5∶35∶65）]和混合溶劑B[85%磷酸-甲醇-水（5∶50∶50）]梯度洗脫（表1）；流速為 0.8 ml/min；檢測波長為288 nm；進(jìn)樣量10 μl；水飛薊賓A、B峰的分離度不得低于1.8。

表1 流動相梯度洗脫時間表

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱定2對照品10 mg、3對照品2.5 mg、4對照品5 mg，分別置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（1）、（2）、（3），2～8 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 供試品溶液的制備

取試制品20粒內(nèi)容物，混勻；精密稱定117 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇90 ml，混勻，超聲處理20 min，加甲醇稀釋至刻度；搖勻，靜置，取上清液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 HPLC測定及圖譜

分別精密吸取對照品溶液（1）、（2）、（3）與供試品溶液各10 μl，進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖1、2）。

供試品溶液各色譜峰的保留時間與相應(yīng)對照品溶液色譜峰保留時間一致。

圖1 對照品溶液色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

2.1.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取室溫存放的供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣5 μl分析，結(jié)果見表2：

表2 室溫保存不同時間樣品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.1.6 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取對照品溶液（1）、（2）、（3）各 5 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖峰面積（表3）。

表3 含量測定的精密度試驗(yàn)測定結(jié)果（n=6）

結(jié)果顯示，HPLC測定的2、3、4的峰面積的精密度RSD在0.1%～1.7%之間。

2.1.7 線性關(guān)系考察

取對照品溶液（1）、（2）、（3），每種分別進(jìn)樣 1、3、5、7 和10 μl，測定色譜圖峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)X，得回歸方程計(jì)算r，結(jié)果分別為：

水飛薊賓：Y＝3 010x+5.303，r＝0.999，濃度范圍 0.105 1 ～ 1.051 0 μg/ml；

異水飛薊賓：Y＝2 869x+0.196，r＝0.999，范圍濃度 0.027 1 ～ 0.271 5 μg/ml；

水飛薊汀：Y＝2 868x-4.647，r＝0.999，濃度范圍 0.055 5 ～ 0.554 7 μg/ml；

水飛薊濘：Y＝3 492x-19.69，r＝0.999，濃度范圍 0.055 1 μg/ml～ 0.550 8 μg/ml；

測定結(jié)果表明，各組份在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液（1）、（2）、（3），分別用甲醇稀釋0、5、10倍，得到高、中、低三種濃度的對照品，分別精密加入到已知濃度試制藥物樣品甲醇溶液中，照HPLC法測定各組分含量，并計(jì)算回收率、RSD（表4）。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，各組分回收率較好，方法可行。

2.2 溶出度測定條件

2.2.1 溶出介質(zhì)的選擇

按照《普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》[9]，并依照USP34，選擇如下溶出介質(zhì)：①pH 1.5鹽酸溶液(取3.73 ml HCl加水稀釋至1000 ml)；②pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液（取250 ml 0.2 mol/L KH2PO4溶液與18 ml 0.2 mol/L NaOH溶液混合，加水稀釋至1000 ml）；③pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液（取250 ml 0.2 mol/L KH2PO4溶液與205 ml 0.2 mol/L NaOH溶液混合，加水稀釋至1 000 ml）；④含2%十二烷基硫酸鈉的pH 7.5磷酸鹽緩沖溶液。

2.2.2 轉(zhuǎn)速及其他條件選擇

USP34標(biāo)準(zhǔn)及水飛薊素膠囊進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)均采用槳法，轉(zhuǎn)速均為100 r/min，本研究條件選擇與其一致。

2.2.3 溶出度測定法

依照溶出度測定法（中國藥典2010年版二部附錄X C第二法），分別用以上溶出介質(zhì)900 ml為溶劑，每杯放入試制品膠囊1粒，或參比藥物膠囊1粒，或精密稱定的裝有含水飛薊素140 mg的原料藥的膠囊一粒，或益肝靈一片，依法操作，并分別在10、20、30、45、60和90 min取溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。照HPLC方法測定，對照品溶液用相應(yīng)溶出介質(zhì)稀釋5倍，計(jì)算每粒膠囊溶出的各組份含量，作溶出度曲線。

2.2.4 溶出度曲線

1各組份的溶出度曲線見圖3。

2.2.5 不同介質(zhì)中的溶出曲線

以各組份含量之和作為1含量，作不同介質(zhì)中的溶出曲線（圖4）。

2.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用非模型依賴法進(jìn)行溶出曲線的比較，試制品和原料藥與參比藥中各組分的溶出曲線對比數(shù)據(jù)見表5，各樣品與參比藥中1的溶出曲線對比數(shù)據(jù)見表6。其相似因子（f2）是衡量兩條溶出曲線相似度的參數(shù)，計(jì)算公式分別如下：

其中n為取樣時間點(diǎn)個數(shù)，Rt為參比樣品在t 時刻的溶出度值，Tt為在t 時刻的溶出度值。f2值越接近100，則認(rèn)為兩條曲線相似。一般情況下， f2值高于50，可認(rèn)為兩條曲線具有相似性，試制品與參比樣品具有等效性。

實(shí)驗(yàn)取樣時間點(diǎn)分別在10、20、30、45、60和90 min，共6個點(diǎn)，當(dāng)藥物溶出量低于85%時，n取值為6；當(dāng)藥物溶出量在某取樣點(diǎn)超過85%時，以后的點(diǎn)不計(jì)入，n取值為去掉這些點(diǎn)后的取樣點(diǎn)個數(shù)。

圖3 1各組份的溶出度曲線

圖4 各組份含量之和在不同介質(zhì)中的溶出度

表5 不同溶出介質(zhì)中各組份的溶出度相似因子（f2）

表6 不同溶出介質(zhì)中各樣品1的溶出度相似因子（f2）

3 討論

1）試制品與參比藥物對比，各試驗(yàn)條件下，各組份f2因子均大于50，顯示二者溶出度具有相似性。

2）從原料藥的溶出度數(shù)據(jù)可知，1所含的各組份在不同pH條件下溶解度有差異，在酸性條件下溶解較差，各組份的溶解度與pH值呈正相關(guān)性，在pH 7.5磷酸緩沖溶液中，組份3、4的溶解度達(dá)60%以上，組份2的溶解度仍然在20%以下。經(jīng)制劑制備處理后，各組份溶出度隨pH值變化趨勢無顯著改變。

3）對溶出度有限制性作用的主要因素是組份2。經(jīng)適當(dāng)方法制成制劑后，組份2溶出度明顯改善，組份3的溶出度比原料藥也有所提高，在pH 7.5磷酸緩沖溶液條件下均可達(dá)到75%以上。各制劑樣品與原料藥比較，組份4的溶出狀況無明顯差異。

4）在pH 1.5鹽酸溶液條件下，各制劑樣品與原料藥比較，雖然f2因子顯示差異不大，但各組份溶出都非常低，無實(shí)際意義。其他試驗(yàn)條件下，市售益肝靈片與參比藥物對比，1的f2因子均小于50，顯示溶出度有明顯差異，市售益肝靈片溶出狀況與原料藥相似。

5）按照USP規(guī)定，以加2% SDS的pH 7.5磷酸緩沖溶液作溶出介質(zhì)，在此條件下，未經(jīng)任何處理的1原料藥也有可能符合溶出75%的要求。這一標(biāo)準(zhǔn)顯然有待商榷。

參考文獻(xiàn)

[1]孫霞, 邱明豐, 李紹順, 等. 水飛薊素滴丸的溶出度研究[J]. 中國中藥雜志, 2005, 30(4): 263-265.

[2]張自然, 陶建生, 鄒凌燕, 等. 水飛薊素原料藥及制劑體外溶出度的研究[J]. 中南藥學(xué), 2007, 5(6): 496-499.

[3]歐少英, 龍曉英, 陳其邦. 水飛薊素快速自增溶給藥系統(tǒng)處方設(shè)計(jì)及體外釋放度研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報, 2004,20(03): 224-225.

[4]王建筑, 李菲, 郝吉福, 等. 水飛薊素包合物和固體分散體的研究[J]. 泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2011, 32(1): 5-8.

[5]謝沐風(fēng). 溶出曲線相似性的評價方法[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2009, 40(4): 308-310.

[6]張啟明, 謝沐風(fēng), 寧保明, 等. 采用多條溶出曲線評價口服固體制劑的內(nèi)在質(zhì)量[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2009,40(12): 946-955.

[7]謝沐風(fēng). 如何科學(xué)、客觀地制訂溶出度試驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2012, 43(3): A23-A32.

[8]李計(jì)萍. 水飛薊素藥學(xué)研究進(jìn)展綜述[EB/OL]. (2005-03-26)[2013-06-04]. http://www.bioon.com/drug/chemdrug/95260.shtml.

[9]《口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》(征求意見稿)[EB/OL].(2012-11-19)[2013-06-04]. http://www.cde.org.cn/zdyz.do?method=largePage&id=177.