環境內分泌干擾物與兒童性早熟發病的關系*

蔡德培 喬麗麗 鄭力行

(1.復旦大學附屬兒科醫院 上海 201102；2.復旦大學公共衛生學院環境衛生學教研室 上海 200032)

兒童性發育異常，特別是性早熟的發病率近年來顯著增高，已成為最常見的小兒內分泌疾病之一。流行病學調查研究發現，上海地區目前兒童性早熟患病率大約為1 000/10萬，男女比例為1 ∶ 5[1]。近年來國外有大量文獻報告顯示，洗滌劑、農藥及塑料工業等向環境排放的物質及其分解產物，可以在自然界產生一系列的環境內分泌干擾物（Environmental endocrine disruptors，EEDs）。當EEDs進入機體后，可以干擾內分泌激素的合成、釋放、轉運、與受體結合、代謝等途徑，從而影響內分泌系統的功能，破壞機體內環境的協調和穩定。這些物質大多具有擬雌激素活性，如果進入兒童體內，與靶器官上的雌激素受體結合，將引致生殖器官及骨骼的提早發育，有可能成為性早熟的致病因素之一[2]。我們曾檢測出性早熟患兒及正常兒童血清中的3種有代表性的EEDs：洗滌劑降解產物—壬基酚（4-NP）、有機氯農藥DDT的代謝產物（P，P’-DDE）和塑料增塑劑—鄰苯二甲酸二乙基己酯（DEHP）的含量，發現當前的正常兒童已較普遍地暴露于EEDs，特別是受到當年大量施放的有機氯農藥DDT所造成的殘毒影響更為明顯，而性早熟患兒暴露于EEDs的程度則還要嚴重得多[3]。鑒于我們的生存環境中常見的EEDs多達數十種，本文選擇了另幾種有代表性的EEDs：洗滌劑降解產物—辛基酚（OP）、合成樹脂原料—雙酚A (BPA)和塑料增塑劑—鄰苯二甲酸二丁酯（DBP），檢測其在性早熟患兒及正常兒童血清中的含量，并同時測定性早熟患兒靶器官的發育指標，包括子宮、卵巢體積及血清雌二醇（E2）水平，通過患兒血清中EEDs的含量與上述指標間的相關性分析，進一步探討EEDs暴露與性早熟發病之間的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 納入標準

收集2005年3月至2005年9月在復旦大學附屬兒科醫院性早熟專科門診就診的初診患兒，性早熟的診斷標準按《性早熟及青春期延遲》[1]。共收集性早熟女孩110例，起病年齡為6.0～8.3歲，初診年齡6.1～11.3歲。

1.1.2 排除標準

凡由中樞神經系統、內分泌系統和生殖系統器質性病變所致的性早熟均被排除在外。

1.1.3 對照組

選取年齡與性早熟組相匹配的正常女孩作為對照，共100例，年齡6.5～11.2歲。

1.2 實驗方法

1.2.1 OP、BPA高效液相色譜檢測

1）樣品采集及預處理 每例采集血清2 ml，-80℃凍存待測。

（1） OP的樣品預處理 取1 ml血清，加入5 ml正己烷，旋渦混勻5 min，取出上層有機層正己烷，50℃水浴中用空氣吹干，用甲醇飽和的正已烷定容至0.1 ml后取上清液20 μL進樣。

（2）BPA的樣品預處理 取0.5 ml血清，加入100μl的0.01 mol/L磷酸緩沖液，20 μl β-葡萄糖酸酐酶，37℃水浴3 h，冷卻后先后用3 ml及2 ml乙醚-正己烷（1∶1）渦旋混勻后各2 min進行萃取，合并兩次萃取的有機層，置于40 ℃水浴中用氮氣吹干，50 μl 40%的乙腈溶解后進樣。

（3）避免污染 為避免洗滌劑污染，實驗用玻璃器皿均用重鉻酸鉀濃硫酸溶液浸泡過夜，清洗烘干，使用前再用正己烷或乙醇淋洗兩次。

2）高效液相色譜分析 采用HP1100高效液相色譜儀檢測

（1）OP的色譜條件 采用Inertsil ODS-3 4.6 mm×250 mm，5 μm色譜柱（日本GL公司）；熒光檢測器（激發波長為275 nm，發射波長為312 nm）柱溫為40 ℃，流動相為甲醇∶水∶三氟乙酸（1000∶50∶1），流速為 1 ml/min，進樣為 20 μl。

（2）BPA的色譜條件 Inertsil ODS-3 4.6 mm×250 mm，5 μm色譜柱（日本GL公司）；流動相為乙晴∶水∶四氫呋喃（40∶60∶3）；檢測波長：激發波長為227 nm，發射波長為310 nm；流速為1 ml/min；柱溫為40 ℃。整個色譜時間為25 min，進樣為20 μl。

（3）定性分析 用OP，BPA標樣測定其保留時間，樣品的定性分析采用與標樣的保留時間相對照的方法進行。

（4）定量分析 樣品處理后進行色譜分析，所得的峰面積與樣品的工作曲線相比較，通過計算得出樣品中含該種物質的實際濃度。

3）標準曲線和工作曲線

配制 20、10、50、100、500、1000 μg/ml的 6 個含量的OP標準品，作濃度—峰面積標準曲線，OP的標準曲線Y=768.78X+20.817，r=0.998 0；OP的工作曲線Y=752.83X+21.32，r=0.997 6。

取不同體積BPA標準應用液，用40%乙腈稀釋成濃 度 分 別 為 0、20、100、500、1 000、2 500 μg/ml的標準溶液，得到BPA的標準曲線Y=654.67X+21.67，r=0.998 2；取0.5 ml不含BPA的混合血清，分別加入濃度為 0、20、100、500、1 000 μg/ml的環境內分泌干擾物、2 500 ng/ml的標準溶液各50 μl，用40%的乙腈充分溶解，進樣20 μl，得到BPA的工作曲線Y=638.15 X+31.35，r=0.991 3。

4）回收率和精密度見表1。

表1 OP、BPA的回收率與精密度

1.2.2 DBP氣相色譜分析

1）樣品采集及預處理

每例采集血清2 ml，-80℃凍存待測。

（1）樣品預處理 取1 ml血清，加入5 ml正己烷，旋渦振蕩器上振蕩5～10 min，3000 r/min離心5 min，取上層正己烷層，用空氣泵吹干，用甲醇飽和的正己烷定容至 200 μl，后取上清液 20 μl進樣。

（2）避免污染 為避免塑料制品的增塑劑對測定的干擾，全部實驗均采用玻璃器皿。

2）氣相色譜分析

采用AL3000氣相色譜儀檢測。

（1）DBP的色譜條件 美國Sigma公司SPB-1氣相毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm ×0.25 μm；柱溫40℃(2.00 min)～15℃/ min～180℃/ min；不分流進樣；載氣N2，流速1.5 ml/min；進樣品溫度250℃；氫火焰離子化檢測器FID，檢測器溫度250 ℃，樣品保留時間為14.28 min。

（2）定性分析 用DBP標樣測定其保留時間，樣品的定性分析采用與標樣的保留時間相對照的方法進行。

（3）定量分析 樣品處理后進行色譜分析，所得的峰面積與樣品的工作曲線相比較，通過計算得出樣品中含該種物質的實際濃度。

3）標準曲線和工作曲線

配制0.3、0.6、6、12、18 μg/L 5個濃度的標準品，做濃度—峰面積標準曲線，標準曲線為Y=0.04X-0.01，r=0.992。

以血清為空白，分別加入不同濃度的標準品，測得的峰面積減去空白值，繪制濃度—峰面積工作曲線，工作曲線：Y=0.04X+0.02，r=0.983 1。

4）回收率和精密度見表2。

表2 DBP的精密度與回收率

1.2.3 子宮、卵巢體積測定

以Hitachi EUB 40型二維超聲診斷儀測量子宮體和卵巢的長、寬、厚，按（π/6×長×寬×厚) cm3公式分別計算子宮體積和兩側卵巢的體積。

1.2.4 血清 E2測定

采用放射免疫分析法測定血清E2含量，試劑盒由美國DPC公司提供。

1.3 統計學方法

應用SPSS 11.0統計軟件，分別對相應數據進行x2檢驗、對數轉換、Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 性早熟患兒及正常兒童血清中OP、BPA和DBP的含量

5.0%的正常兒童血清中檢測出OP，33.6%的性早熟患兒血清中檢測出OP；2.0%的正常兒童血清中檢測出BPA，40.9%的性早熟患兒血清中檢測出BPA；4.0%的正常兒童血清中檢測出DBP，27.3%的性早熟患兒血清中檢測出DBP。性早熟患兒的血清中OP、BPA及DBP含量均顯著高于正常兒童（P＜0.001，表3）。

表3 性早熟女孩及正常兒童血清中OP、BPA、DBP的含量 (μg/L)

2.2 性早熟患兒及正常兒童血清中OP、BPA及DBP含量的分布情況

兩組血清OP、BPA及DBP含量增高人數的構成比，性早熟患兒明顯高于正常兒童，差異有統計學意義（表4）。

表4 性早熟患兒及正常兒童血清中OP、BPA及DBP含量分布 n(%)

2.3 性早熟患兒及正常兒童子宮、卵巢體積及血清雌二醇含量

性早熟患兒的子宮、卵巢體積及血清雌二醇含量均數均高于正常兒童（表5）。

2.4 性早熟患兒血清EEDs含量與子宮卵巢體積、血清E2含量的相關性分析

患兒血清OP、BPA、DBP的含量與其子宮體積均呈顯著正相關，血清OP、DBP的含量與其卵巢體積也均呈顯著正相關，即血清EEDs的含量越高，生殖器官的病變程度也越嚴重（表6）。

表5 性早熟患兒和正常兒童子宮體積、卵巢體積、血清E2含量

表6 性早熟患兒血清中EEDs含量及與子宮和卵巢體積、血清E2含量的相關性分析

3 討論

EEDs是指環境中存在的能夠干擾機體內分泌系統諸環節并導致異常效應的物質。EEDs可影響天然激素的合成、分泌、轉運，并與激素受體結合，可產生擬雌激素活性或抗雄激素活性，從而可改變人類和野生動物內分泌系統的功能，導致生殖、發育和行為異常[4-5]。近年來國外有大量文獻報告顯示，洗滌劑、農藥及塑料工業等向環境排放的物質及其分解產物，可在自然界產生一系列的EEDs。

這些物質具有一些共同的生物學特點，例如在環境中化學性質穩定，可長期存在；大多脂溶性強且易被機體吸收，但不易被生物降解和排出，并可通過食物鏈在生態系統內進行生物富集蓄積。EEDs可經某些途徑，包括污染的水源、食物或經皮膚被兒童攝入后吸收。本研究結果顯示，作為對照組的正常兒童，有5.0%的血清中檢測到OP，2.0%的血清中檢測到BPA，4.0%的血清中檢測到DBP，說明當前正常兒童已有一部分暴露于EEDs。

EEDs大多為小分子物質，他們雖然在化學結構上與雌激素有所不同，但同樣可以與靶器官上的ER結合。ER上具有多個配體結合部位，某些部位可與天然雌激素結合，而其他部位則可與多種EEDs結合。當EEDs與ER結合后，可以相互之間、也可以與天然雌激素間發揮協同作用，激發雌激素效應的產生。處于發育階段的靶器官，對EEDs的作用則更為敏感，如果受到較明顯的EEDs污染或受到多種EEDs的污染，則可引起靶器官的顯著病變。青春期兒童正處于發育階段，對EEDS遠較成人敏感，很低的劑量就可能對下丘腦—垂體—性腺軸造成不良影響。本研究結果顯示，33.6%的性早熟患兒血清中檢測到OP，40.9%血清中檢測到BPA，27.3%血清中檢測到DBP，且從EEDs的血清含量分布情況來分析，性早熟患兒EEDs的暴露程度比正常對照組兒童嚴重得多，說明EEDs與兒童性早熟的發病有密切關系。

OP是雌激素活性最強的烷基酚類物質的降解物。有研究報道未成年雌鼠暴露于OP可使成年時子宮重量增加，BPA能從塑料制品中擴散出來引起環境和食物的污染。1993年Krishnan等首次發現高壓滅菌時，BPA從碳酸酯塑料瓶中擴散出來，并具有雌激素活性。后來，又有人發現食品包裝容器或塑料薄膜中的BPA污染了食品或飲料。DBP作為塑料的增塑劑，被廣泛應用于塑料制品的生產加工中。隨著使用的增多和時間的推移，特別是作為垃圾廢棄和焚燒，可滲出至環境中，造成污染。DBP可通過食物鏈在生態系統中，特別是在水生生物體內進行富集和濃縮，并可達到相當高的濃度。Puerto Rico大學的Washam在2000年測定了波多黎各島41例乳房早發育女孩與35例正常女孩的血液樣品，發現乳房早發育女孩血清DBP的濃度明顯高于對照組，68.0%乳房早發育女孩的血液樣品中可以檢測出DBP，與之相比，只有1例正常女孩血液中可以檢測出DBP，排除其它干擾因素，推測鄰苯二甲酸酯類制品可能與當地女孩乳房的早發育有關。

本研究結果顯示患兒血清OP、BPA、DBP、DEHP的含量與其子宮、體積均呈顯著正相關，血清OP、DBP、DEHP的含量與卵巢體積也均呈顯著正相關，說明EEDs對靶器官病變有顯著作用，是兒童性早熟的重要致病因素之一。

總之，從本研究的上述結果可初步得出下列結論：當前正常兒童已有一部分暴露于EEDs，性早熟患兒EEDs暴露程度比正常兒童嚴重得多；EEDs的暴露與兒童性早熟的發病有著密切關系，是其重要的致病因素之一。

我們的研究結果應當引起政府有關方面的重視，可作為有關部門制定及完善相關產業和環保方面政策法規的客觀依據，并希望能夠盡快制定出適合國情的防治方案，以避免更多兒童受到EEDs的不良影響。

[1]蔡德培. 性早熟及青春期延遲[M]. 上海: 上海科學技術文獻出版社, 2005: 23, 29-33.

[2]Ozen S, Darcan S. Effects of environmental endocrine disruptors on pubertal development[J]. J Clin Res PediatrEndocrinol, 2011, 7(4): 197-207.

[3]蘆軍萍, 鄭力行, 蔡德培. 性早熟患兒血清中環境內分泌干擾物的測定和分析[J]. 中華預防醫學雜志, 2006, 40(2):88-92.

[4]蔡德培. 環境內分泌干擾物引致兒童性發育異常的研究進展[J]. 上海醫藥, 2013, 34(2): 3-5.

[5]蔡德培, 蘆軍萍. 中藥對環境內分泌干擾物的擬雌激素活性拮抗作用[J]. 上海醫藥, 2013, 34(4): 33-36.