利用分子標記鑒定四川省馬鈴薯品種

唐銘霞，何衛，胡建軍，王克秀，王余明，劉冬

（四川省農業科學院作物研究所，四川成都610066）

利用分子標記鑒定四川省馬鈴薯品種

唐銘霞，何衛*，胡建軍，王克秀，王余明，劉冬

（四川省農業科學院作物研究所，四川成都610066）

以15個馬鈴薯育成品種和引進品種為材料，采用微衛星分子標記技術鑒定供試馬鈴薯品種。研究檢測了4個SSR位點在15份馬鈴薯育成品種（系）中的多態性。在15份馬鈴薯品種（系）中，共檢測到等位基因26個，每對引物檢測到的等位基因個數最少為5個，最多為10個，平均6.5個。PIC（Polymorphism information content）值最高為0.9288；最低為0.8597，平均PIC值為0.8857。僅利用少數幾對高PIC值的SSR引物，即能將全部供試品種（系）區分，因此，SSR技術有利于高效準確的鑒定馬鈴薯品種。

SSR；馬鈴薯；品種鑒定

隨著馬鈴薯產業的發展，對育種提出了更高的要求。在育種實踐中，傳統鑒定方法主要采取形態比較，但由于受環境及主觀因素的影響而效率較低。另外，由于現代育種研究中的新品種多由數量有限的一些優良品種作親本雜交育成，新品種遺傳基礎狹窄，品種之間的形態學差異越來越小，造成可供品種鑒定利用的形態性狀不足，增加了品種鑒定的困難。分子標記反應DNA水平遺傳差異，與傳統鑒定方法相比，在種質資源的鑒定、評價以及種質資源遺傳多樣性分析等方面具有較大優越性。

SSR分子標記技術目前已經在多個領域得到應用，它的一個重要潛在應用領域是品種鑒定和品種產權保護。新品種獲得品種權的重要前提是具備特異性，即明顯不同于同一物種內的所有其他品種。為便于品種間的比較，要求測試數據易于保存、處理和交流。目前SSR標記在國外已應用于部分農作物的品種產權保護。

研究采用SSR分子標記法進行馬鈴薯品種鑒定，有效解決馬鈴薯品種混雜和品種鑒定等問題，對于馬鈴薯生產、加工、育種、常規檢驗以及種質資源保護等都具有非常重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 驗試材料

供試材料來源于四川省農業科學院的15個栽培品種，見表1。

表1 15份馬鈴薯材料的名稱與來源Table 1 The name and origin of 15 potato cultivars

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取

DNA提取采用改良CTAB法提取馬鈴薯新鮮葉片總DNA。稀釋到20~100 ng/μL，并置于4℃保存備用。1.2.2 SSR基本程序擴增反應的試劑與儀器

使用Eppendorf PCR儀，Taq酶和dNTPs購于TAKARA生物產品有限公司。

根據徐敏[1]研究結果，反應總體積為20 μL：模板DNA 50 ng，20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，4.0 mmol/L MgCl2，400 μmol/L dNTPs，0.8 μmol/L引物，Taq DNA聚合酶1 U，用雙蒸水調整終體積至20μL，最后加15μL石蠟油覆蓋。

反應程序如下：94℃預變性2 min，然后94℃變性30 s，Tm復性45 s，72℃延伸45 s，進行35個循環，最后于72℃延伸10 min，緩慢冷卻至4℃下保存。引物共4對[2,3]，由上海英駿生物技術有限公司合成。PCR結束后，在6%聚丙烯酰胺變性凝膠上電泳，凝膠電泳在北京六一的DYY10C型電泳儀上進行。電泳結束后，將膠板用銀染法顯影。

1.2.3 多態性信息量的計算

按照Anderson等[4]的方法。參照Harker等[5]，對于同一SSR引物擴增出幾個片段且位點個數不明的情況，仍作為一個位點計算，無效等位基因（Null allele）作為一個等位基因，根據Smith等[6]的公式計算多態性信息量（Polymorphism information content, PIC），即PIC=1-Σfi2，其中f為i位點的基因頻率。采用Nei和Li[7]的方法計算遺傳相似系數：GS=2Nxy/ (Nx+Ny)，式中Nx代表x的總帶數，Ny代表y的總帶數，Nxy為兩個體x、y共有的條帶數。

2 結果與分析

2.1 引物篩選

從170對SSR引物中篩選出4對多態性較高、分辨率較高、帶型清楚的引物。其引物序號分別為STM1052，StI002，StI012和StI057。表2為篩選出的4對引物。為評價不同引物的品種鑒別力，計算了4對引物的PIC值，以StI057最高，為0.9288；其次StI012，為0.8896；最低的是STM1052，為0.8597（表2）。4對引物的平均PIC值為0.8857。

表2 試驗所用SSR引物Table 2 SSR primers used in this experiment

2.2 品種區分鑒定

利用4對引物對15份馬鈴薯品種進行擴增，所有品種均能擴增通過SSR引物擴增出的譜帶，可以將全部供試馬鈴薯品種區分開。例如：引物StI012可以完全區分15個樣品中的6個樣品，而引物STM1052可以將引物StI012區分不開的四組完全區分開來，StI002和StI057組合也可完全區分所有供試品種。15個樣品遺傳相似度見表3。

表3 15個樣品遺傳相似度Table 3 Genetic similarity of 15 samples

3 討論

分子標記技術作為一種新的品種資源鑒定技術要應用于生產實際,應該滿足穩定性好、分辨率高、多態性強、效率高和方便快捷。SSR標記是繼RAPD標記后出現的基于PCR反應的DNA標記技術，SSR標記結果穩定，重復性好，因此SSR反應體系利于在實驗室間進行交流[8]。

利用SSR技術進行品種鑒定的方法是穩定可靠的。隨著分子標記技術的不斷發展和完善，SSR技術將在DNA水平上鑒別不同品種是否存在差異,從而科學、準確地判斷特定品種的特異性、一致性和穩定性，為保護育種、鑒定和檢測馬鈴薯品種真實性提供客觀、科學和準確的技術保障。

四川作為馬鈴薯栽培重要省份,長期栽培馴化，已經培育出很多新品種。本研究將四川省引種和培育的馬鈴薯品種進行鑒定區分。結果表明，僅利用幾個高PIC值的SSR位點，就能夠將參與試驗的全部品種區分。在馬鈴薯育種中，品種的選育集中在產量、品質、抗逆、抗病等性狀上，這使得部分與上述性狀連鎖的SSR位點多態性大大降低。但在馬鈴薯基因組中仍存在著大量與上述性狀未發生連鎖或者連鎖不緊密的SSR位點，利用這部分SSR位點的多態性則可以將選育的品種區分。因此，利用SSR標記高效準確的進行馬鈴薯品種鑒定是完全可行的。

[1]徐敏.中國馬鈴薯審定品種系譜分析及遺傳多樣性研究[D].北京：中國農業科學院,2007.

[2]Ghislain M,Spooner D M,Rodriguez F,et al.Selection of highly informative and user-friendly microsatellites(SSRs)for genotyping ofcultivated potato[J].Theor ApplGenet,2004,108:881-890.

[3]Feingold S,Lloyd J,Norero N,et al.Mapping and characterization of new EST-derived mirosatellitesforpotato(Solanum tuberosum L.)[J]. Theor Appl Genet,2005,111:456-466.

[4]Anderson JA，ChurchillGA,Autrique JE,etal.Optimizing parental selection for genetic linkage maps[J].Genome,1993,36:181-168.

[5]Harker N,Rampling L R,Shariflou M R,et al.Microsatellites as markers for Australian wheat improvement[J].Aust J Agric Res, 2001,52:1121-1130.

[6]Smith JS C,Chin E CL,Shu H,etal.An evaluation ofthe utility ofSSR loci as molecular markers in maize(Zea mays L.):comparisons with data from RFLPS and pedigree[J].Theoretical and Applied Genetics, 1997,95:163-173.

[7]Nei M,Li W.Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1979,76(10):5269-5273.

[8]匡猛,楊偉華,許紅霞,等.分子標記技術在棉花品種鑒定上的研究進展[J],棉花學報,2009,21(4):330-334.

Identification of Different Potato Cultivars(Solanum tuberosum L.) in Sichuan Province with Molecular Markers

TANG Mingxia,HE Wei＊,HU Jianjun,WANG Kexiu,WANG Yuming,LIU Dong
(Crop Research Institute,Sichuan Academy of Agriculture Sciences,Chengdu,Sichuan 610066,China)

Fifteenpotato cultivars(lines)wereidentifiedusing microsatellitemolecularmarkertechnology.Polymorphismof fourSSRlociin the fifteen potato cultivars(lines)was examined in this research.In the fifteen potato cultivars(lines),26 alleles in total were detected,ranging from 5 to 10 per set of primer pairs,with an average of 6.5.The polymorphism information content (PIC)value of SSR loci varied from the lowest of 0.8597 to the highest of 0.9288,averaging 0.8857.A few SSR primers of high PIC value could distinguish all cultivars in this research.Therefore,SSR technology could be used to identify potato cultivars (lines)efficiently.

SSR;Solanum tuberosum;cultivar identification

S532

A

1672－3635（2013）01-0006-03

2012－12－31

四川省馬鈴薯育種攻關項目（2011NZ0098－4）。

唐銘霞（1982-），女，助理研究員，主要從事馬鈴薯生物技術及組培研究。

何衛，主要從事馬鈴薯栽培生理生態和抗病遺傳育種等研究，Email：hewei2008@yahoo.com.cn。