馬鈴薯塊莖休眠解除過程的形態學觀察與鑒定

文義凱，劉柏林,，盧蔚雯，張寧，司懷軍,*，王蒂

（1.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省干旱生境作物學省部共建國家重點實驗室培育基地，甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅農業大學，甘肅蘭州730070）

栽培生理

馬鈴薯塊莖休眠解除過程的形態學觀察與鑒定

文義凱1，劉柏林1,2，盧蔚雯1，張寧1，司懷軍1,2*，王蒂2

（1.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省干旱生境作物學省部共建國家重點實驗室培育基地，甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅農業大學，甘肅蘭州730070）

利用石蠟切片分析了室溫儲存條件下馬鈴薯栽培品種‘Favorita’塊莖休眠解除過程中的形態組織學變化，并對塊莖中的淀粉和蛋白質含量的變化作了研究。結果顯示，馬鈴薯塊莖在休眠期芽眼分生組織細胞停止分裂，伴隨著休眠的解除，芽眼分生組織細胞開始分裂且分裂速度越來越快，芽原基最終形成一個完整的芽，伴隨此過程，觀察到芽原基周圍部分細胞程序性死亡最終發育形成環紋、螺紋導管的現象；馬鈴薯塊莖從休眠解除到芽的萌發過程中淀粉含量則出現下降且淀粉顆粒逐漸由規則卵圓形變為較小的不規則狀，在靠近芽原基的分化部位蛋白質含量有明顯上升趨勢。室溫儲存60 d的塊莖被認為完全解除休眠。

馬鈴薯；塊莖；休眠；組織學；細胞學

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界第四大糧食作物，又是重要的蔬菜作物和食品及工業加工原料[1]。馬鈴薯塊莖的休眠與發芽對于馬鈴薯的種植栽培以及生產加工極為重要[2]。馬鈴薯種植栽培中，塊莖的休眠程度對其出苗率、整齊度和產量均有影響，生產加工上塊莖的休眠程度影響著馬鈴薯的運輸儲藏以及商品質量和應用價值[3,4]。由于對馬鈴薯塊莖休眠機理了解的欠缺，人工調控技術發展緩慢[5]，嚴重制約了馬鈴薯種薯生產的發展和塊莖作為工業加工原料的充分利用。因此，對馬鈴薯塊莖休眠與發芽的研究顯得越來越迫切。研究馬鈴薯塊莖休眠機理，對馬鈴薯栽培和儲藏保鮮等方面也具有很重要的意義[6]。休眠與發芽是馬鈴薯塊莖生長發育過程中的一個階段，馬鈴薯塊莖成熟收獲至發芽的過程中，芽眼分生組織發生一系列的形態改變。確定塊莖可見芽萌發前的形態變化，對于鑒定塊莖休眠解除所需時間具有重要意義。本試驗對馬鈴薯塊莖在休眠解除過程中的形態組織學變化以及淀粉和蛋白質含量變化進行了研究，利用顯微技術來判斷塊莖休眠解除所需要的具體時間。為進一步研究休眠的內部機理，探索工業化控制馬鈴薯塊莖休眠的技術，提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源

馬鈴薯栽培品種‘Favorita’試管苗由甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室提供。

1.1.2 材料的固定與保存

馬鈴薯微型薯由甘肅省渭源縣田源澤馬鈴薯良種專業合作社生產。試管苗于2011年7月移栽至溫度（22±2）℃、相對濕度60%~70%溫室培養，2011年10月收獲大小均勻、成熟度一致、重量（3±0.5）g的薯塊，室溫放置15 d后于黑暗（20±2）℃條件下進行儲藏試驗，每隔5 d，取形態一致的微型薯3個，采用單面刀片縱切帶有芽眼的塊莖，置于FAA固定液中固定保存。該處理步驟一直持續到種薯的芽長至5 cm為止。

1.2 試驗方法

1.2.1 脫水、透明、浸蠟和包埋

（1）脫水：將用FAA固定液固定好的材料分別在30%、50%、70%、83%、95%和100%各級酒精中進行處理，各自處理2 h，以使材料脫去水分變硬而容易與石蠟更好的融合。

（2）透明：透明劑為二甲苯，先用1/2二甲苯進行過渡處理2 h，再用純二甲苯處理2 h，以除去在脫水過程浸入的酒精，利于下一步的浸蠟和包埋。

（3）浸蠟：將材料中的二甲苯倒出，留下大約3/4體積，再在石蠟：酒精為3：2的混合液體中在37℃下處理3 d。在56～60℃的恒溫箱中用100%的石蠟連續處理3次，時間分別為1 h。

（4）包埋：用100%的石蠟將處理后的材料包埋于特制小盒中，以備切片。

1.2.2 切片及染色

（1）切片：將修好的蠟塊用單面刀片修整好，經旋轉切片機切片，切片厚度10 μm。將其固定于涂有梅氏蛋清液的載玻片上待用。

（2）脫蠟：用兩組染色缸分別對切片進行脫蠟和復水。脫蠟采用1/2二甲苯和二甲苯處理5 min,然后將脫蠟后的切片經各級濃度酒精逐漸下降到水。

（3）染色：組織形態學觀察采用番紅-固綠二重染色。PAS法做淀粉的組織化學染色，汞-溴酚藍法做蛋白質的組織化學染色。

（4）石蠟切片的封藏及顯微照相：將完成染色的石蠟切片用加拿大樹膠封藏并整理好，并在Motic745型數碼顯微鏡下觀察并照相。

2 結果與分析

2.1 形態組織學變化分析

收獲后室溫儲藏15 d的休眠塊莖（圖1），由外向內的結構依次是周皮、表皮、皮層、維管束環和髓部。最外層為周皮，其下2～3層細胞體積較小，形狀不規則，排列緊密而彼此鑲嵌，為表皮細胞。表皮細胞中未觀察到淀粉粒。皮層薄壁組織細胞和髓薄壁組織細胞體積較大，近圓形，細胞壁薄含有豐富的淀粉顆粒。維管束環3～4層細胞將皮層和髓部分開，其間的薄壁細胞不含淀粉粒。芽眼里的芽呈扁平狀，分生組織沒有細胞分裂的發生（圖2）。儲藏45 d后，塊莖頂端分生組織細胞開始分裂，說明塊莖休眠打破，芽眼開始萌動（圖3）。頂端原始芽位于表皮層中央，細胞具有液泡，細胞核大，但核仁不明顯，其下為亞頂端原始細胞，細胞略成團排列，核仁明顯。肋狀分生組織細胞5～6列細胞位于亞頂端原始細胞下，細胞較大且排列有序，其液泡化程度較大。周緣分生組織細胞沿頂端外形輪廓排列，細胞相對于肋狀分生組織細胞為小，但同樣排列有序且緊密。芽生長錐由扁平開始凸起（圖3），肋狀分生組織細胞由上向下呈明顯的細胞下移位現象，并劃分出一定的區域梯度。由上向下，細胞首先變得愈狹長，細胞核越小。15 d之后，當轉到快速分裂期時，細胞漸趨矩形。隨著細胞分裂的加快，細胞體積增大，分化葉原基凸起，當休眠期通過時，生長錐變成半球狀，最后形成芽（圖4）。在馬鈴薯塊莖儲藏60～65 d左右細胞分裂速度可能達到最大值，這時的芽開始快速生長（圖5），肉眼可見芽出現，塊莖休眠完全解除。在塊莖休眠解除初期（儲藏45 d后），皮層薄壁組織細胞在接近維管束環處的部分細胞細胞核變大，細胞質變濃（圖6），隨著芽原基持續分化，核仁消失，細胞伸長，分化成管狀分子（圖7），塊莖芽形成之時，這些管狀分子與旁側毗鄰管狀分子相連，其壁呈環紋或螺紋加厚，形成導管（圖8）。導管分子的分化以維管束環開始，伸入芽中。整個過程中未觀察到篩管分化。

圖1 儲存15 d馬鈴薯塊莖橫切（×10）Figure 1 Tuber cross section after 15 d storage（×10）

圖2 儲存15 d芽的變化（×10）Figure 2 Bud growth change after 15 d storage（×10）

圖3 儲存45 d芽的變化（×10）Figure 3 Bud growth change after 45 d storage（×10）

圖4 儲存60 d芽的變化（×10）Figure 4 Bud growth change after 60 d storage（×10）

圖5 儲存65 d芽的變化（×10）Figure 5 Bud growth change after 65 d storage（×10）

圖6 儲存45 d導管形態（×10）Figure 6 Tuber vessel shape after 45 d storage（×10）

圖7 儲存60 d導管形態（×10）Figure 7 Tuber vessel shape after 60 d storage（×10）

圖8 儲存65 d導管形態（×10）Figure 8 Tuber vessel shape after 65 d storage（×10）

2.2 淀粉和蛋白質分布及其消長動態

在進入到馬鈴薯塊莖休眠解除過程中，淀粉和蛋白質的分布和含量會發生一系列的變化。此變化特征與馬鈴薯塊莖芽萌發的解剖特征相一致。

圖9 儲存15 d淀粉顆粒分布（×40）Figure 9The distribution of starch granules after 15 d storage（×40）圖10 儲存15 d淀粉顆粒和蛋白質分布（×40）Figure 10The distribution of starch granules and protein after 15 d storage（×40）

圖11 儲存45 d淀粉顆粒和蛋白質分布（×40）Figure 11The distribution of starch granules and protein after 45 d storage（×40）圖12 儲存45 d淀粉顆粒、蛋白質和導管分布（×40）Figure 12The distribution of starch granules,protein and vessel after 45 d storage（×40）

圖13 儲存60 d蛋白質分布（×40）Figure 13Thedistributionofproteinafter60dstorage（×40）圖14 儲存60 d淀粉顆粒分布（×40）Figure 14The distribution of starch granules after 60 d storage（×40）

從儲藏15 d的休眠塊莖中可以看到被染成紫紅色的淀粉粒大小一致，呈均勻的圓形或卵圓形，在皮層和髓部的薄壁組織細胞中均勻分布著。近芽眼端的皮層薄壁組織細胞中，淀粉顆粒均勻地圍繞著細胞核，含量一致。塊莖中的被染成藍色的蛋白質含量極為稀少（圖9，圖10）。儲藏45 d的馬鈴薯塊莖中，伴隨著芽萌發的開始，近芽眼端的皮層薄壁組織細胞中，淀粉顆粒明顯變少變小，形狀也由圓形和卵圓形變得較為不規則，馬鈴薯塊莖蛋白質的含量也相應的增加。在細胞核周圍出現較多藍色蛋白質，部分細胞中甚至已不存在淀粉粒，表明淀粉顆粒在不斷的分解消耗。在皮層薄壁組織部分細胞脫分化形成導管分子時，其原生質中已經完全沒有淀粉粒（圖11，圖12）。當儲存至60 d時，由于在芽的萌發過程中，芽眼附近分生組織細胞分裂迅速，需要大量的核酸和蛋白質以及其它的一些營養物質，在芽眼附近這種轉化趨勢更加明顯，淀粉分布及消長動態體現明顯的極性。從髓薄壁組織細胞到皮層薄壁組織細胞淀粉粒數量由多到少，體積由大變小，形狀變得不規則，呈梯度分布。接近芽和維管束的薄壁組織細胞中已不含淀粉粒（圖13，圖14）。

3 討論

3.1 馬鈴薯塊莖芽原基的分化和發育

試驗結果表明，馬鈴薯塊莖自收獲之日起整個組織的細胞分裂以及物質合成等一系列生命活動并非完全停止，而是一些基因處于被抑制狀態，組織的代謝水平也處于一個比較低的水平但生命活動仍在進行并非停止。當休眠開始打破芽開始萌發時，馬鈴薯塊莖芽眼處的頂端分生組織細胞開始分裂，芽生長錐由扁平開始突起，分生組織細胞不但出現由上向下位移的位置變化，而且出現了細胞形態的變化，首先是細胞由上向下變得愈來愈狹長，之后逐漸趨于矩形，直到幼芽的形成。隨著馬鈴薯塊莖芽眼處的頂端分生組織細胞開始分裂，皮層薄壁組織細胞部分細胞經過脫分化及細胞程序性死亡過程，構成了環紋導管和螺紋導管。已知環紋導管和螺紋導管直徑較小，輸水能力較弱，多在器官早起生長過程中出現，本試驗的觀察結果恰好證實了這一點。由試驗觀察表明，馬鈴薯塊莖側芽發生后韌皮部退化、木質部發達，因此推測馬鈴薯塊莖側芽發生初期主要從皮層和髓部攝取水分和無機營養。

3.2 馬鈴薯塊莖芽原基的分化和發育過程中淀粉和蛋白質的變化動態

馬鈴薯塊莖從休眠到芽的萌發過程中，各種儲藏物質發生變化，其中淀粉不斷地降解成還原性糖，所以淀粉含量在休眠打破的整個過程中都在不斷下降[7]。由于馬鈴薯塊莖在休眠狀態下細胞分裂停止，細胞代謝比較緩慢，蛋白質的合成也處于一個比較低的水平，所以在這個過程當中，淀粉含量基本上沒什么變化，但是當休眠解除，芽開始萌發時，細胞分裂顯著加快，代謝也明顯加快，這時需要合成大量的核酸和蛋白質以及一些其他的大分子物質。在芽的萌發過程中，特別是在芽眼附近由于需要大量的蛋白質這種趨勢尤為明顯。在芽的萌發過程中，也需要大量的能量，這些能量都需要馬鈴薯的塊莖提供，主要是靠糖類的降解來提供，結果導致淀粉因降解在塊莖中的含量不斷變少。試驗結果顯示，馬鈴薯塊莖中的淀粉顆粒主要儲藏在皮層和髓部的薄壁組織細胞中，在芽的萌發過程中，淀粉粒在靠近芽眼的部位明顯減少且淀粉粒大小呈現出明顯變小和形態變得不規則的趨勢。馬鈴薯塊莖在休眠解除過程中，蛋白質的分布和積累趨勢與淀粉的相反。在皮層和髓部的薄壁組織細胞中積累了大量淀粉，芽原基分生組織細胞和維管束環細胞中卻不含淀粉粒，而是逐漸積累了豐富的蛋白質。

[1]魏延安.世界馬鈴薯產業發展現狀及特點[J].世界農業,2005 (3):29-32.

[2]高志勇.馬鈴薯轉基因工程研究進展[J].貴州農業科學,2009,37 (1):18-20.

[3]張麗莉,陳伊里,連勇.馬鈴薯塊莖休眠及休眠調控研究進展[J].中國馬鈴薯,2003,17(6):32-38.

[4]蒲建剛,孫林祥,裴建文,等.脫毒馬鈴薯微型薯原原種打破休眠試驗研究初報[J].甘肅農業科技,1999(7):13-15.

[5]司懷軍,張寧,王蒂.馬鈴薯塊莖休眠和發芽的分子機理及調控策略[J].中國馬鈴薯,2007,21(2):104-107.

[6]王鵬.馬鈴薯離體塊莖休眠生理研究[D].中國農科院,2001.

[7]Loon C D van.The effect of a cold shock on dormancy of potatoes[J]. Potato Research,1983,26(1):79-81.

Observation and Identification of Potato Morphological Changes during Tuber Dormancy Release

WEN Yikai1,LIU Bailin1,2,LU Weiwen1,ZHANG Ning1,SI Huaijun1,2＊,WANG Di2
(1.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu 730070,China; 2.Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science,Gansu Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu 730070,China)

The changes in histology,and starch and protein content of potato variety'Favorita'tuber dormancy breaking process were investigated by paraffin section methods.The results showed that tuber eye meristematic tissue cells stopped dividing in dormancy state and started dividing rapidly along with dormancy breaking.Finally,a bud was formed gradually by bud primordium.The partialprogrammed celldeath around bud primordium eventually formed annularvesseland spiralvessel.The content of starch decreased,and ovoid starch granule changed into small irregular one.The protein content increased dramatically around bud primordium during the period of tuber dormancy breaking to sprouting.It is considered that tuber dormancy break completely 60 days afterstorage atroomtemperature.

Solanum tuberosum L.;tuber;dormancy;histology;cytology

S532

A

1672－3635（2013）01-0014-05

2012-07-19

國家自然科學基金項目（30871573和31160298）。

文義凱（1984-），男，碩士，教輔，從事馬鈴薯遺傳育種研究。

司懷軍，博士，教授，主要從事馬鈴薯生物技術和分子生物學研究，E-mail:hjsi@gsau.edu.cn。