馬鈴薯病毒的常用檢測方法

劉玲玲，韓黎明，張尚智，禹娟紅

（定西師范高等?？茖W校生化系，甘肅定西743000）

馬鈴薯病毒的常用檢測方法

劉玲玲*，韓黎明，張尚智，禹娟紅

（定西師范高等?？茖W校生化系，甘肅定西743000）

目前常用馬鈴薯病毒檢測的方法，主要包括寄主生物學檢測法、抗血清檢測法、電子顯微鏡檢測法、酶聯免疫檢測法和分子生物學檢測法。重點討論了分子生物學方法中的各種RT-PCR方法。同時對各種方法的優缺點進行了比較，并總結出將傳統生物學檢測技術、免疫學檢測技術和分子生物學檢測技術相結合必將成為檢測植物病毒最經濟有效的手段。

馬鈴薯病毒；檢測方法；統計；分析

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.），是世界上種植和食用國家最多的作物之一[1]。馬鈴薯是以無性繁殖為主的作物，很容易感染病毒，當病毒侵入馬鈴薯體內以后，主要通過改變馬鈴薯細胞的代謝途徑，使馬鈴薯正常的生理機能受到干擾和破壞，導致馬鈴薯發生病毒病。馬鈴薯病毒病是影響馬鈴薯產量和品質的主要病害，目前已報道的感染馬鈴薯的病毒多達35種，類病毒1種，其中分布廣泛、危害嚴重的馬鈴薯病毒有馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯A病毒（PVA）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）和馬鈴薯M病毒（PVM）等[2]。同時多種病毒可復合感染，加重了危害程度。但是由于馬鈴薯病毒病缺乏有效的防治藥劑，病毒病可繼代相傳，從而導致種薯退化，商品薯降低甚至絕產，造成嚴重的經濟損失[3]。

自從植物發現病毒以來，國內外的科學家們都在努力地尋找著適合某種病毒相對應的檢測方法，隨著科學技術的進步，各種檢測病毒的方法相繼問世。

1 寄主生物學檢測法

傳統的生物學測定方法是以植物病毒在寄主上的表觀癥狀作為識別病害和檢測病毒的基礎。寄主生物學檢測法主要包括直觀檢測法和指示植物檢測法兩種。

1.1 直觀檢測法

直觀檢測法是根據病毒在馬鈴薯植株上的表現癥狀來判斷感病情況，即根據植株莖葉是否表現出某種病毒所特有的可見癥狀來確定病毒感染程度。

1.2 指示植物檢測法

指示植物檢測法最早是由美國的病毒學家Holmes[4]在1929年發現的。指示植物又稱鑒別寄主，指的是對某種或某些特定病毒非常敏感，被感染后癥狀表現十分明顯的植物。常用的幾種馬鈴薯病毒的指示植物[5]（見表1）。

表1 幾種馬鈴薯病毒的指示植物及其感病癥狀Table 1 Indicator plants and syptoms of some potato viruses

從受檢馬鈴薯植株上取下葉片或者其他組織并研磨，通過摩擦或者媒介昆蟲將汁液接種到寄主植物上使其細胞受到侵染，經過一段時間后指示植物即可表現癥狀，通過觀察指示植物所表現出來的相應癥狀來檢測馬鈴薯內有無病毒以及帶何種病毒。2003年，吳凌娟等[6]用多種指示植物分離鑒定PVX，結果表明千日紅是一種很好的鑒定指示植物，因其發病時間短,易觀察。指示植物檢測法對于大批馬鈴薯試管苗生產的檢測不適用，但在PVX、PVY、PVS等病毒株系檢測上用的比較多[7]，并廣泛應用于分子生物學或血清學檢測之前的初步鑒定。

寄主生物學檢測法是進行病毒檢測常用的一種方法，也是進行植物病毒診斷檢測的重要依據。但是，單獨使用此法存在著一定的局限性，一方面有些病毒在寄主植物上并不表現明顯的可見癥狀，或是只有經過相當長時間才能表現可見癥狀；另一方面由于田間病毒病癥狀易受到病毒種類和株系、寄主品種和生育期、氣候及環境條件的影響而發生變化。但是，作為認識植物病毒的基礎，寄主反應的生物學意義仍然無法替代。把病毒的寄主生物學方法和分子生物學方法有效結合將為更好地認識植物病毒提供新的研究系統[8]。

2 抗血清檢測法

植物病毒是由核酸和蛋白質組成的核蛋白，因而是一種較好的抗原，給動物注射后會產生抗體，這種抗原和抗體結合會引起血清凝集或沉淀反應，即抗原和抗體之間發生的高度專一的免疫反應，借助這種反應就可用已知病毒的抗血清鑒定未知病毒的種類。這個過程在很短時間內即可完成，因此病毒的抗血清檢測法既靈敏又快捷，是目前常用的一種病毒檢測方法。

3 電鏡檢測法

自從Kausche等[9]首次在電鏡下看到煙草花葉病毒（TMV）以后，電鏡檢測法已成為植物病毒研究必不可少的常規手段之一。電鏡技術是通過觀察植物病毒顆粒形態、大小、結構、內含體組成形狀和亞結構等方面的特征來確定病毒的存在和種類?，F代電鏡的分辨率可達到0.5 nm，因此利用電鏡觀察，比生物學檢測更直觀，而且速度更快。目前運用的電鏡負染技術和超薄切片技術觀察能夠診斷和檢測植物病毒。超薄切片技術尤其對一些未知病毒，難于提純的病毒材料，負染技術不能解決的檢測材料都可進行，通過對組織細胞的直接觀察而得到解決，因此在病毒學檢測和脫毒快繁的實際生產中均有著特殊的重要性和不可取代的作用[10]。

4 酶聯免疫吸附檢測法

酶聯免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）是把抗原-抗體的免疫反應與酶的催化反應相互結合而發展起來的一種綜合性技術。自Casper[11]應用ELISA方法鑒定了PLRV病毒后,這一技術在馬鈴薯病毒檢測中得到了應用。經不斷改進和提高，目前已形成間接ELISA、雙抗體夾心法（DAS-ELISA）、三抗體夾心法（TAS-ELISA）、異種動物抗體夾心法、A蛋白酶聯法、點免疫結合技術（Dot-ELISA,DIBA）等多種測試方法[12]。2000年，白艷菊等[13]通過改進應用快速DAS-ELISA法對5種馬鈴薯病毒PVX、PVY、PVS、PVM、PLRV同時檢測。2006年，宋吉軒等[14]分別用改進DAS-ELISA法和常規DAS-ELISA法檢測PVX、PVY、PVS、PLRV4種馬鈴薯病毒，顯示出直觀、實用、快速、準確可靠、靈敏度高等優點。目前TAS-ELISA技術應用于馬鈴薯病毒檢測的不多[1]。張仲凱等[15]用TAS-ELISA檢測了馬鈴薯脫毒苗，并做了幾種檢測方法的比較，結果表明TAS-ELISA的靈敏度遠高于DAS-ELISA的靈敏度。2006年，劉成科等[16]用TAS-ELISA檢測了百合無癥病毒，其靈敏度也高于DAS-ELISA和間接ELISA。DIBA既可采用直接ELISA，也可采用間接ELISA進行檢測，通常間接靈敏度要高于直接法。

5 分子生物學檢測法

傳統的生物學病毒檢測法靈敏度低，且費時費力，以病毒為基礎的抗血清和酶聯免疫檢測法雖然靈敏度有所提高，但仍不能很好地檢測含量極少的韌皮部病毒及休眠種薯中的病毒[17]。分子生物學檢測法從核酸水平檢測病毒，因而靈敏度高、特異性強，能克服血清學及其他檢測方法中的一些缺點，可以進行大批量的樣本檢測，是目前發展最快、且最有發展前景的病毒檢測技術[18]。

5.1 反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測法

PCR是一種體外擴增DNA技術，常規PCR可檢測植物DNA病毒，RT-PCR可檢測植物RNA病毒。大多數植物病毒為RNA病毒，需要將RNA反轉錄成cDNA再進行PCR反應，此方法稱為RTPCR[1]檢測法。2005年，關翠萍等[19]用一步RT-PCR法對馬鈴薯中的PVX、PVY和PLRV做了檢測，由此提出了馬鈴薯病毒一步法RT-PCR檢測技術。袁青等[20]用二重RT-PCR快速檢測PVY和PLRV，PVX和PVA的混合病毒，結果表明，此法適用于大量樣品的快速制備，并為馬鈴薯病毒病的早期診斷提供了一定的依據。陳陽婷等[21]運用三重RT-PCR快速檢測法對馬鈴薯中的多種復合感染病毒（PVX、PVS和PVA；PVX、PVS和PLRV；PVX、PVA和PLRV；PVS、PVA和PLRV）進行檢測，建立了三重RTPCR檢測技術。代廷非[22]運用多重RT-PCR技術檢測了馬鈴薯的多種病毒。多重RT-PCR技術可同時檢測幾種病毒，節約時間并提高了工作效率[23]。

5.2 指示分子NASBA檢測法

該檢測法是以RNA轉錄為基礎的等溫擴增法，適用于RNA病毒的擴增，一般可通過分子雜交判斷擴增結果，也可在有雙鏈DNA存在的情況下實現對單鏈RNA的特異擴增，具有高度的特異性[24]。目前此法可以對多種不同類病毒甚至同一類病毒的不同株系進行同時檢測[25,26]。

5.3 核酸雜交檢測技術

核酸雜交技術是指具有互補序列的兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，將已知核酸序列制成含有某種標記的探針，再與互補的待測樣品核酸雜交，帶有探針的雜交核酸能指示病原的存在。目前有核酸斑點雜交技術（Nucleic acid spot hybridization,NASH）和PCR微量板雜交檢測技術兩種。1983年，Maule等[27]報道了應用NASH檢測病毒。1993年，Querci[28]用該方法成功的檢測了PVX不同分離株系。但是NASH也存在一定的缺點，比如在檢測大量樣品時，探針的分離比較困難。而且在檢測休眠種薯中的病毒時，檢測靈敏度還不高，尤其對于PVY和PLRV兩種病毒[29]。

6 結論

以上所歸納總結的幾種方法都是馬鈴薯病毒檢測的常用方法，每種方法都有其各自的優缺點，如傳統生物學檢測技術準確、直觀、易于操作，但耗時長，已經遠不能適應生產的需要?？寡鍣z測法快速、靈敏，適于大規模樣品的檢測，但是在抗血清的制備上存在著很多不足。但在生產實踐中，具體使用哪一種檢測方法就要根據病毒的不同類型，技術掌握程度，設備等具體條件的不同，選擇最適宜的檢測方法。

隨著分子生物學技術的不斷改進和完善及相關儀器的普及推廣，分子生物學的檢測技術勢在必行，但是也存在著很多缺點，所以將傳統生物學檢測技術、免疫學檢測技術和分子生物學技術相結合必將成為最經濟有效的檢測手段。

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Common Test Methods for Potato Virus Detection

LIU Lingling＊,HAN Liming,ZHANG Shangzhi,YU Juanhong
(Department of Biochemistry,Dingxi Teachers College,Dingxi,Gansu 743000,China)

The common test methods for potato virus detection were reviewed,including host biology detection, antiserological detection assay,electron microscopy,enzyme-linked immunosorbent assay and molecular biological detection assay,with emphasis on the various RT-PCR methods of molecular biology methods.At the same time,the merit and demerit were compared with different methods,concluding that the combination of traditional biological detection,immunological detection and molecularbiology detection technology would be the mostcost-effective means fordetection ofplantviruses.

potato virus;detection method;statistic;analysis

S532

B

1672－3635（2013）04-0239-04

2013-04-08

定西師范高等專科學校校級科研項目（1316）。

劉玲玲（1977-），女，講師，碩士，主要從事生物技術在作物遺傳育種中的應用研究。

劉玲玲，E-mail：llliu112@163.com。