馬鈴薯轉基因技術與應用

邢錚，秦玉芝,2*，潘妃，曹可，王利群，賀熱情

（1.湖南農業大學園藝園林學院，湖南長沙410128；2.湖南省馬鈴薯工程技術研究中心，湖南長沙410128；3.植物功能基因組學與發育調控湖南省重點實驗室，湖南長沙410082）

綜述

馬鈴薯轉基因技術與應用

邢錚1，秦玉芝1,2*，潘妃1，曹可1，王利群3，賀熱情3

（1.湖南農業大學園藝園林學院，湖南長沙410128；2.湖南省馬鈴薯工程技術研究中心，湖南長沙410128；3.植物功能基因組學與發育調控湖南省重點實驗室，湖南長沙410082）

馬鈴薯轉基因技術在馬鈴薯種質資源創新、生理機制研究中占有重要地位。目前應用于馬鈴薯的基因轉化方法主要有基因槍法、微束激光法和農桿菌介導法。隨著馬鈴薯轉基因技術的發展，相繼獲得了一批抗病毒、真菌、細菌性病害的種質資源，并在基因功能研究材料創新上取得進展，研究馬鈴薯的抗性機制，開展馬鈴薯基因的功能研究將會成為趨勢。

遺傳轉化；再生體系；種質資源

馬鈴薯是世界上繼小麥、水稻和玉米之后的第四大糧食作物。中國是世界上馬鈴薯生產第一大國[1,2]。由于遺傳背景狹窄，傳統的育種技術已難以承載馬鈴薯種質資源創新面臨的巨大挑戰[3]。轉基因技術經過短短30年的發展,大大加速了農作物更新換代的速度及種植業結構的變革[4]，利用轉基因技術在馬鈴薯病蟲害防治、改善品質、創新種質資源、生理機制研究等方面取得了很好的成果，陸續培育出了一些抗病抗蟲的轉基因新品種[1]，而且利用轉基因技術制造馬鈴薯基因突變體是進行馬鈴薯生理機制和信號傳導研究的一條重要途徑[5]。

1 馬鈴薯轉基因技術

轉基因技術就是運用重組DNA技術將外源目的基因導入受體細胞或組織，改變其遺傳組成后產生物質及其后代的一整套技術。目前應用于馬鈴薯的基因轉化方法主要有基因槍介導轉化法、微束激光穿刺轉化法和農桿菌介導轉化法。

1.1 基因槍介導轉化法

基因槍介導轉化法是一種依賴高速度的金屬顆粒將外源基因引入活體細胞，然后通過細胞和組織培養技術，再生出植株的一種轉化技術。基因槍成功地應用于植物基因轉化，具有無宿主限制、可控度高、操作簡便迅速、受體類型廣泛等優點，但轉化成本高、嵌合體比率大、遺傳穩定性差。

李昌等[6]在2002年應用基因槍法成功轉化馬鈴薯‘費烏瑞它’∶將攜帶有Fmdvp1全長基因的質粒pBI131SP1用金粉作微彈轟擊莖段，獲得馬鈴薯再生植株。檢測分析證明已成功地將目的基因導入馬鈴薯基因組中，且其PCR檢測得出的轉化率達7.6%。

1.2 微束激光穿刺轉化法

微束激光穿刺轉化法是利用微束激光照射受體材料，外源DNA便借助于細胞內、外滲透壓差經穿刺小孔直接進入組織細胞。這一設想首先在動物和人的細胞中實驗并取得成功[7,8]。植物實驗方面，王蘭嵐等[9]利用該技術首次獲得了轉基因小麥植株。

隨后微束激光穿刺轉化法被應用在馬鈴薯轉化實驗中。付道林等[10]利用微束激光穿刺技術，將菜豆Ⅰ型幾丁質酶基因導入馬鈴薯栽培品種，來提高馬鈴薯對真菌性病害的抗性。郭志宏等[11]用微束激光穿刺將RNA干擾載體導入馬鈴薯品種‘費烏瑞它’，其Southern-blot檢測結果顯示外源基因導入的拷貝數在2～4之間，這有別于農桿菌介導轉化得到的轉基因植株，農桿菌導轉化的轉基因植株一般以單拷貝為主的特點，導入的外源基因是多拷貝的。

1.3 農桿菌介導法轉化法

農桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌。人們將目的基因插入到經過改造的Ti（誘瘤）質粒或Ri（誘根）質粒T-DNA區，借助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合。農桿菌介導轉化馬鈴薯的外植體包括葉片、莖段和試管薯薄片。用葉片作外植體進行轉化的時間較早，周壯志等[12]用馬鈴薯葉片作外植體實現了Cry3A和Vhb基因向馬鈴薯的轉化。該試驗中對轉化再生植株進行PCR和DNA印跡分析表明，外源基因已整合到馬鈴薯基因組中，且連續三代無性繁殖后轉基因仍存在。白云鳳等[13]建立了一種無標記農桿菌介導轉化馬鈴薯葉盤的方法。在栽培品種‘紫花白’上的試驗檢測結果表明，遺傳轉化效率可達5.1%。

薯片作外植體也應用得較早，并且越來越多的實驗室傾向于使用薯片作外植體。朱青等[14]所在的實驗室在2004年用試管薯薄片作外植體將擬南芥低溫誘導Cor15a的啟動子成功轉入馬鈴薯。再生植株的PCR檢測和PCR-Southern鑒定結果證明，Cor15a啟動子已經成功地轉入到馬鈴薯植株基因組中。該實驗室至今仍然使用薯片作為外植體，并有很好的技術經驗積累。

隨著實驗技術的發展，去除腋芽的馬鈴薯莖段被用作外植體，且實驗證明比葉片更適合侵染轉化。辛翠花等[15]進行的遺傳轉化體系的優化及轉基因植株獲得的實驗，以‘Desiree’葉片和莖段為外植體，分別比較了不同轉化條件對遺傳轉化效率的影響。結果表明∶以莖段為外植體，預培養2 d后以OD600=0.5的菌液侵染10 min，在加有1.0 mg∕L反式玉米素（ZT-t）的MS（加蔗糖20 g∕L）選擇培養基上的遺傳轉化率最高，其愈傷誘導率可達80%，芽分化率可達70%。莖段材料的高分化率有助于提高轉化陽性率。

農桿菌介導轉化法的轉化效率相比基因槍法略低，但其對儀器設備要求較低，反而在實際操作中得到了更多的應用。以上農桿菌介導實驗所用的外植體、誘導培養基組成等總結于表1。

2 馬鈴薯轉基因技術在種質資源創新中的應用

2.1 抗病毒性病害資源創新

馬鈴薯因病毒侵染使其種性退化和嚴重減產，而將病毒外殼蛋白基因轉入馬鈴薯，合成的無毒病毒外殼可以誘導產生過敏反應，激發一系列防衛反應，產生組織或全株抗性。

自首次報道轉入煙草花葉病毒外殼蛋白基因的煙草和番茄具有抵抗病毒侵染的能力后[16]，相繼報道了轉入馬鈴薯X病毒（PVX）、Y病毒（PVY）、卷葉病毒(PLRV)外殼蛋白基因以及同時轉入PVX+PVY外殼蛋白基因的馬鈴薯株系[17-21]。宋艷茹等[22]將PVY外殼蛋白基因通過致瘤農桿菌介導轉化馬鈴薯品種‘Favorita’、‘虎頭’和‘克新4號’。試驗結果表明∶轉基因馬鈴薯植株染色體上整合有PVY-CP基因，并且轉基因馬鈴薯植株中PLRV增殖情況較未轉入基因的對照有所降低，同時轉基因馬鈴薯生長發育正常。南相日等[23]用PLO（Poly-L-Ornithine）將外源PLRV-CP基因導入到‘大西洋’原生質體中，獲得了轉化后代。蚜蟲接種PLRV，結果比對照明顯抗PLRV，說明PLRV-CP基因已經整合到馬鈴薯基因組中。

表1 部分試驗中農桿菌介導轉化馬鈴薯所用外植體、培養基組成Table 1 Explants and medium composition in some Agrobacterium-mediated transform experiments

2.2 抗真菌性病害資源創新

轉基因技術使植物獲得抵抗真菌性病害能力的機理有∶降解真菌細胞壁；阻礙真菌蛋白質合成；滲透蛋白殺菌；引起過敏反應[24]。馬鈴薯真菌病以晚疫病為主。目前利用轉入降解細胞壁物質基因來提高馬鈴薯抗晚疫病的能力。

李汝剛等[25]將缺失C端信號肽序列的Osmotin和在第96位氨基酸處發生琥珀突變的Osmotin置于CaMV雙35 S啟動子驅動下轉化馬鈴薯，獲得NPTⅡ抗性植株。且其研究表明∶Osmotin蛋白的胞外分泌賦予轉基因馬鈴薯葉片抗晚疫病的能力。李先平等[26]通過根癌農桿菌介導，用Harpin轉化馬鈴薯四倍體品種‘大西洋’（Atlantic），獲得107個馬鈴薯轉化株系，其中7株的抗病性與對照相比差異極顯著（P＜0.01）。結果初步表明，Harpin已整合到馬鈴薯的基因組中并得到表達，提高了植株的晚疫病抗性。

2.3 抗細菌性病害資源創新

馬鈴薯細菌性病害主要有青枯病、黑脛病、軟腐病、環腐病、瘡痂病和紅芽病。其中青枯病的致病機理是致病菌通過傷口侵入，進入木質部并擴散至植物上部，通過脂多糖識別寄主，產生大量胞外多糖造成維管束堵塞，分泌胞外蛋白酶降解細胞壁，從而導致寄主植物快速萎蔫[27,28]。目前主要向馬鈴薯轉入抗菌肽基因來提高抗細菌性病害能力。

賈士榮等[29]將抗菌肽Cecropin B、Shiva A的單價基因Cecropin B、Shiva A及Cecropin B∕Shiva A雙價基因通過農桿菌介導法導入中國7個馬鈴薯主栽品種（系）中,獲得了1050個轉基因株系。抗病性鑒定從75個株系中篩選得到了3個比起始品種抗病性提高1～3級、達到中抗的株系。邢小萍[30]對馬鈴薯四倍體普通栽培種‘甘農薯1號’通過農桿菌介導轉化抗菌肽Shiva A基因進行了初步研究，環腐病菌接種實驗初步測定表明轉基因植株均具有一定的抗性。

2.4 基因功能研究材料創建

隨著馬鈴薯基因組測序工作取得的進展，馬鈴薯基因功能的研究也進入了一個嶄新的階段。2013年沈云龍等[5]用pBI載體，以‘鄂馬鈴薯3號’為受體，通過農桿菌介導，獲得一批T-DNA插入突變體，其中包含一個長薯形突變體株系。

3 轉基因技術在馬鈴薯種質資源創新上的展望

隨著轉基因技術的發展，現在的研究者在導入目的基因片段的同時，越來越多地傾向于避免和減少不必要核酸片段進入受體植物，這樣不僅在一定程度上保證了生物安全性問題，也能減少非必要核酸片段對試驗的影響，提高了研究成果的可靠性和真實度。轉基因技術在馬鈴薯種質資源創新上得到了很多的應用，在獲得更多優質高效的品種的同時，研究馬鈴薯的抗性機制，以及開展馬鈴薯基因的功能研究將會成為未來的發展趨勢。

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Application and Technology of Potato Transformation

XING Zheng1，QIN Yuzhi1,2＊，PAN Fei1，CAO Ke1，WANG Liqun3，HE Reqing3
(1.College of Horticulture and Landscape,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 410128,China；2.Hunan Provincial Engineering Research Center for Potatoes,Changsha,Hunan 410128,China；3.Hunan Province Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Developmental Regulation,Changsha,Hunan 410082,China)

ract:Potato transgenic technology plays an important role in germplasm enhancement and physiological mechanism research.Currently used potato genetic transformation methods include particle bombardment,micro-beam laser method and Agrobacterium-mediated transformation.With the development of potato transgenic technology,a number of anti-viral,fungal,bacterial diseases germplasm and some gene function study materials have been accessed,which will become a trend to research potato resistance mechanisms and gene function studies.

rds:genetic transformation；regeneration system；germplasm

S532

A

1672－3635（2013）06-0370-04

2013-10-25

“十二五”農村領域國家科技計劃課題“馬鈴薯綜合育種技術研究與新品種選育”(2012BAD02B05-8)；農業部馬鈴薯產業技術體系“南方冬作區稻田栽培”(CARS-10-P19)；公益性行業（農業）專項“南方丘陵旱地帶狀復合種植系統高產高效關鍵技術研究”(201203096)；2012年湖南省研究生科研創新項目(CX2012B299)。

邢錚（1987-），男，碩士研究生，主要從事馬鈴薯逆境生理方面的研究。

秦玉芝，副教授，主要從事逆境生理與蔬菜遺傳育種方面的研究，E-mail∶qyuz@163.com。