腫瘤干細胞(CSCs)放療抵抗機制的研究進展

燕 麗(綜述) 喬田奎 范 衛(審校)

(復旦大學附屬金山醫院腫瘤科 上海 200540)

隨著腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)這一概念的提出，越來越多的研究探討CSCs在腫瘤治療中作用，已有研究發現CSCs是腫瘤治療后復發的根源，根治腫瘤首先應該根除CSCs[1］。手術是治療腫瘤的最佳選擇，但很大一部分患者前來就診時已經失去了手術的最佳時機。放療是腫瘤治療中的主要手段之一，約70%的患者需要放療的參與，但放療后腫瘤往往還會復發，這多與腫瘤中存在的小部分CSCs對放療存在抵抗有關。本文就CSCs產生放療抵抗的機制作一綜述。

CSCs DNA損傷修復能力與放療抵抗 DNA 作為射線對細胞作用的關鍵靶點，其損傷后迅速修復是放療耐受的關鍵原因[2］。DNA損傷后，首先損傷應答激酶細胞周期檢測點激酶ATM和ATR接收DNA損傷的信號，發生磷酸化，隨后激活一系列細胞周期檢測點效應分子如激活效應酶Chk2和Chk1等，最終引起細胞周期阻滯或直接進行DNA損傷后的修復[3］。

細胞周期阻滯與DNA修復 許多研究發現[4-6］，不同損傷原引起DNA損傷后，機體啟動p53、ATMChk2、ATR-Chk1DNA損傷應答通路，引起G1、S和 G2期的阻滯，使受損細胞有足夠的時間來自我修復從而產生放療抵抗，同樣射線引起CSCs DNA損傷后，其損傷的DNA也會通過細胞周期阻滯來進行修復。田允鴻等[7］用無血清懸浮法富集 MCF-7細胞系中CSCs，探討其細胞周期與射線照射后產生耐受之間的關系，流式細胞儀分析細胞照射前后其細胞周期變化，Western blot法測定照射前后G2期相關蛋白pCDC25C含量，結果乳腺癌干細胞在經射線照射前后G2期細胞含量分別為22.03% ±2.12%和45.83% ±2.25%(P ＜0.01)，pCDC25C 在照射后表達明顯增高，而貼壁培養的乳腺癌細胞照射前后細胞周期及周期相關蛋白均無明顯差異，可見乳腺癌干細胞經射線照射后出現的G2期阻滯可能與其放療耐受特性相關。那么G2期相關蛋白pCDC25C是如何發揮作用的呢?馬曉潔[3］曾提出細胞通過G2/M期阻滯進行自我修復涉及的路徑為損傷信號→ATM/ATR激活→Chk2/Chk1激活→CDC25CSer26位點磷酸化;損傷信號→ATM/ATR激活→P53激活→14-3-3σ激活，14-3-3σ與磷酸化的CDC25C結合使CDC25C磷酸酶失去對細胞周期相關蛋白CDC2-Tyr15位點去磷酸化的功能→CDC2活性抑制→CDC2/cyclinbB抑制→G2，可見pCDC25C作用至關重要。Furnari等[8］提出DNA損傷后產生磷酸化的CDC25C的細胞會同時產生胞質蛋白14-3-3δ結合點，最終留在胞質不能進入細胞核，導致 G2/M 期阻滯。Lopez-Girona等[9］認為DNA損傷引起細胞周期檢測點激活，而后在Chk1及Rad24的協助下將磷酸化的CDC25C從細胞核中排除，導致G2/M期阻滯。Hambardzumyan等[10］提出膠質瘤干細胞產生放療抵抗與細胞周期調控蛋白Chk1、Chk2有關，用 Chk1、Chk2蛋白抑制劑 DBH將其阻斷后，細胞周期調控阻斷，經射線照射，膠質瘤細胞系D456MG中CD133+細胞較CD133-細胞對射線的敏感性明顯增加。王彬[11］通過CD133免疫磁珠分選惡性膠質瘤細胞株的U251中的CD133+細胞，射線照射后，細胞周期分析發現CD133+細胞大多數處于G0～G1期，占88.2l%，G0～G1期阻止了細胞的增殖，從而對放療產生耐受。細胞周期阻滯會導致放療耐受，但其背后的分子機制尚需進一步研究，深入了解相關腫瘤放療后其特定的周期阻滯及引起該周期阻滯的信號轉導機制，可以進行靶向阻斷，解除細胞周期的阻滯并最終解除放療耐受。

DNA損傷修復基因表達與放療耐受 Gaedcke等[12］曾指出細胞損傷后其死亡還是存活與相關基因的表達密切相關。那么CSCs放療損傷后其基因表達情況又是如何呢?陳寶敏等[13］在人膠質瘤干細胞系中篩選出了與DNA損傷修復相關的MGMT基因，其在常規培養條件下的膠質瘤中不表達，但在干細胞培養條件下呈現輕度增高表達;Hegi等[14］提出該基因與DNA損傷修復相關。可以推測該基因在細胞損傷修復中起重要作用。李治等[15］將人乳腺癌干細胞經過8Gy射線的照射后，發現其ATM和Ku70/Ku80的基因表達水平上調且表達量明顯高于非乳腺癌干細胞。ATM和Ku70/Ku80的基因產物能夠在細胞DNA出現損傷時保護損傷的DNA不被降解，并加速損傷DNA的修復，從而通過細胞凋亡產生放療耐受。Chang等[16］也指出敲除SirT1基因可明顯增加膠質瘤干細胞的照射敏感性，其原因可能與該基因參加細胞周期調控及DNA損傷修復相關。

除了CSCs，致瘤性間質干細胞與射線抵抗相關的基因表達也有報道。Horsman等[17］研究產生放療耐受的人致瘤性間質干細hMSC-TERT20-CE8在不同劑量的放射線下其基因表達情況，結果發現CE8克隆系的細胞內發現了15種已經證實的基因過度表達，其中表達增長5倍以上的包括CTSC、GMFG、EFEMP1、NNMT、CXCL1、CASP1 基因。通過信號轉導的路徑分析發現這些基因與腫瘤細胞致瘤性、細胞增生、細胞凋亡、DNA復制、重組關聯重大。其中基因NNMT的表達促進尼克酰胺的降解和排泄，而尼克酰胺可以阻擋斷裂的單鏈DNA的修復，從而使損傷DNA的修復速率增加。這項研究也發現BAX、CDKN1A和MDM2基因明顯增加，而這些基因表達的最終結果是促進細胞的凋亡并將細胞阻滯在G1/S期，從而抑制細胞的有絲分裂，即在腫瘤間質干細胞細胞受到損傷后，既有促進細胞凋亡的基因表達，又有促進細胞損傷修復的基因表達，因此可根據腫瘤細胞不同的基因表達水平預測其對射線的敏感性。從基因水平上探究CSCs與放射線之間的關系，有助于從基因水平上闡明CSCs抵抗放射治療的機制，提供增強腫瘤患者放射治療敏感性的基因靶點。

DNA損傷修復相關蛋白激活或聚集與放療耐受 Marchetti等[18］提出DNA損傷后會有173種蛋白質表達水平的增加和磷酸位點的改變，其中任瑞平等[19］總結過DNA損傷修復蛋白包括 H2AX(磷酸化組蛋白)、ATM(細胞周期蛋白)、CDKNlA(細胞周期相關酶抑制蛋白)、TP53(腫瘤抑制相關蛋白)等在DNA損傷修復中的作用。

Bao等[20］在腦膠質瘤中發現CD133+的膠質瘤干細胞，其經過短期射線照射后體外培養的CD133+細胞比未經照射的富集了4倍，體內生長的腦膠質瘤經過同樣處理后CD133+細胞比未處理的富集了3～5倍。通過單細胞凝膠電泳測定技術發現:無論是異體移植的膠質瘤還是人腦膠質瘤，在接受放療后CD133+細胞中的DNA周期檢測點蛋白(ATM Rad17，Chk1 and Chk2)比 CD133-細胞中的檢測點蛋白活性高出許多，且其存活率是CD133-細胞的4～9倍，可見DNA損傷檢測點蛋白的高活化狀態導致癌癥干細胞更有效地對損傷DNA進行修復，結果在接受放射性治療后幸存。

DNA的損傷包括單鏈和雙鏈DNA損傷，其中DNA發生雙鏈斷裂后最早反應之一是位于斷裂點附近的組蛋白H2AX的c末端絲氨酸殘基發生磷酸化，形成 γ-H2AX[21］。Wu 等[22］提出磷酸化的 r-H2AX能快速轉導DNA損傷信號，招募DNA損傷檢測點蛋白MDC1和DNA修復蛋白復合物到DNA損傷點形成DNA修復焦點。并且 Rothkamm等[23］指出無論何種因素誘導的雙鏈DNA的損傷都伴隨有H2AX的磷酸化，而且都要經歷聚焦后消失的過程，可見磷酸化γ-H2AX組蛋白對于DNA損傷修復起著至關重要的作用。Booher等[24］先前的研究也發現，在放射治療的干預下CSCs的存活比例明顯高于非CSCs;并發現CSCs對射線的抵抗性增高也是通過激活細胞周期檢測點蛋白實現的，在小鼠的乳腺癌干細胞中γ-磷酸化H2AX組蛋白聚集后消融的速率明顯高于非乳腺癌干細胞，可見乳腺癌干細胞DNA損傷后修復速率要快得多。Al-Assar等[25］根據CSCs特異性標記物的不同，用熒光激活細胞/磁珠法分選不同類型腫瘤細胞系中的CSC，隨后檢測經射線照射后其γ-磷酸化H2AX組蛋白消失速度，結果發現乳腺癌干細胞、胰腺癌干細胞Panc-1和PSN-1其γ-H2AX的消失速度要快的多，提示其有耐受輻射作用。但事實上，只有乳腺癌干細胞產生了抵抗射線照射的結果。這說明并非所有CSCs都表現出輻射抵抗及γ-H2AX的快速消失，或者通過CSC表面標記物分選CSCs的方法在研究其特性的問題上尚存在質疑，用這種方法分選的CSCs并不能很好地表示CSCs的特性，這對以后我們分選及研究CSCs有較大的啟示。我們可以利用DNA損傷修復蛋白抑制劑特異性地阻斷CSCs的損傷后修復，進一步提高腫瘤患者的放療敏感性。

CSCs與其微環境的相互關系

CSCs與周圍血管 董雪濤等[26］提出腦CSCs定居于血管周圍小生境中，受小生境中細胞因子和信號通路分子的調節以維持其干細胞特性、保持自我更新和分化的平衡以及是否從小生境中遷出，同時腦CSCs也分泌一些細胞因子以維持小生境結構，破壞保護腦CSCs的小生境，可能使腦CSCs失去對不同劑量射線和化學藥物的抵抗性。李明武等[27］在腦膠質瘤組織中，發現血管內皮細胞可表達CSCs的標記物CD133+和Nestin+。由此認為，腫瘤內微血管可能來源于CSCs的分化，推測CSCs可能以促進血管再生及定居于血管周圍的方式使腫瘤處于足氧狀態從而產生輻射抵抗。

乏氧效應 腫瘤組織內乏氧細胞的存在是影響射線照射效應的重要因素。細胞含氧狀態對射線輻射殺傷作用有很大影響:射線對乏氧細胞殺傷力減弱，對氧合細胞殺傷力明顯增強。腫瘤組織常有供血不足及乏氧細胞比率高的問題，部分癌細胞可逃避放射損傷，這是放療后腫瘤再生長及復發的常見原因之一。乏氧微環境下，乏氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)高表達，最新研究結果表明[28］，HIFs可以誘導與CSCs自我更新和多能性相關的基因表達，包括Oct4和Notchl等，它們在乏氧微環境中經過一系列信號轉導，最終使CSCs保持在未分化狀態或者使CSCs的分化得到抑制。Platet等[29］將3種腦膠質瘤和2種少突膠質細胞瘤株分別在20%和3%氧環境下培養，結果發現在3%氧環境培養下各種細胞株的CD133+細胞比例較20%氧環境培養時均明顯上升，可見乏氧環境下增殖明顯增加。Xing等[30］提出乏氧環境下乳腺癌細胞中Notch受體和Notch配體Jagged2的表達明顯上調，而且Jagged2配體在骨髓基質細胞中也有發現，其通過激活Notch信號途徑的轉導促進CSCs的自我更新。Oliveira等[31］用免疫組化分選出CD44+口腔癌干細胞，并發現在乏氧環境下其乏氧誘導因子σ和CD44+同時表達時對口腔癌的治療效果產生明顯的影響。

其他 谷胱甘肽是修復受損DNA所必需的巰基化合物，與腫瘤放射敏感性之間呈負相關。Mitchell等[32］曾經指出高能輻射對DNA的損傷作用包括直接損傷和間接損傷，射線對DNA分子鏈的直接作用為單鏈斷裂和雙鏈斷裂;間接作用是射線對水分子的電離，產生自由基，自由基再與生物大分子一起作用于DNA鏈，此時細胞內的谷胱甘肽作為一種自由基清除劑在亞致死腫瘤細胞的修復上起重要作用，谷胱甘肽在放療后表達水平增高與放療敏感性有很大關聯。Croker等[33］在 ALDHhiCD44+乳腺癌干細胞的研究中發現其明顯的輻射抵抗與其細胞內高表達谷胱甘肽S-轉移酶、P糖蛋白等有關。可見明確谷胱甘肽產生的來源并將其靶向阻斷有利于腫瘤放射治療的進展。

結語 隨著CSCs在各類腫瘤中不斷被分選出來，越來越多的研究說明CSCs在腫瘤放射治療中起著重要的作用，CSCs的消滅與否關聯到腫瘤能否得到根治，而目前要想克服CSCs對各種射線的抵抗還面臨著不少的挑戰。首先，在現有的基礎上進一步研究并證實CSCs輻射耐受的機制，包括射線照射后CSCs完整的DNA損傷后修復機制、基因調控、損傷修復的信號轉導途徑、CSCs與小生態環境包括乏氧環境之間的相互作用機制等。其次，在明確CSCs輻射抵抗的機制后，尋求逆轉該抵抗的分子靶向治療，如以CSCs DNA損傷檢測點為靶點阻斷射線照射后DNA的修復;以細胞周期轉換關鍵酶為靶點，阻斷關鍵酶的作用，解除CSCs細胞周期的阻滯;了解射線照射后基因的轉錄表達后，靶向阻斷抵抗射線的基因表達而提高射線增敏基因的表達;在明確乏氧環境對CSCs放射敏感性影響的前提下，探究是否可通過創造足氧環境提高腫瘤放射敏感性等，從而徹底消除CSCs對放射治療的抵抗，達到根治腫瘤的目的。

由此可見，解決CSCs射線抵抗將為腫瘤的根治提供良好的應用前景。

[1］Ho A，Fusenig N.Cancer stem cells:a promising concept and therapeutic challenge [J］.IntJ Cancer，2011，129(10):2309.

[2]余子豪，谷銑之，殷蔚伯.腫瘤放射治療學[M］.北京:中國協和醫科大學出版社，2008:18，231-232.

[3]馬曉潔，譚榜憲.輻射損傷修復應答與放射增敏[J］.腫瘤預防與治療，2010，23(3):256-258.

[4］Pellegata NS，Antoniono RJ，Redpath JL，et al.DNA damage and p53-mediated cell cycle arrest:a reevaluation[J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93(26):15209-15214.

[5］Shiotani B，Kobayashi M，Watanabe M，et al.Involvement of the ATR-and ATM-dependent checkpoint responses in cell cycle arrest evoked by pierisin-1[J］.Mol Cancer Res，2006，4(2):125-133.

[6］Pichierri P，Rosselli F，Franchitto A.Werner's syndrome protein is phosphorylated in an ATR/ATM-dependent manner following replication arrest and DNA damage induced during the S phase of the cell cycle[J］.Oncogene，2003，22(10):1491-1500.

[7］田允鴻，謝國柱，任陳，等.懸浮培養乳腺癌干細胞放療抵抗與G2期阻滯相關[J］.南方醫科大學學報，2011，31(1):53-56.

[8］Furnari B，Blasina A，Boddy MN，et al.Cdc25 inhibited in vivo and in vitro by checkpoint kinases Cds1 and Chk1[J］.Mol Biol Cell，1999，10(4):833-845.

[9］Lopez-Girona A，Furnari B，Mondesert O，et al.Nuclear localization of Cdc25 is regulated by DNA damage and a 14-3-3 protein[J］.Nature，1999，397(6715):172-175.

[10]Hambardzumyan D，Squatrito M，Holland E C.Radiation resistance and stem-like cells in brain tumors[J］.Cancer Cell，2006，10(6):454-456.

[11]王彬.腦膠質瘤干細胞放射敏感性的離體研究[D］.第三軍醫大學:第三軍醫大學外科學(神經外科)，2008.

[12]Gaedcke J，Grade M，Jung K，et al.KRAS and BRAF mutations in patients with rectalcancertreated with preoperative chemoradiotherapy[J］.Radiother Oncol，2010，94(1):76-81.

[13]陳寶敏，董軍，沈云天，等.人腦膠質瘤干/祖細胞系SU-2放射耐受及其相關機制的初步研究[J］.中國現代神經疾病雜志，2008，8(5):453-459.

[14]Hegi ME，DiserensAC，GodardS，etal.Clinicaltrial substantiates the predictive value of O-6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter methylation in glioblastoma patients treated with temozolomide[J］.Clin Cancer Res，2004，10(6):1871-1874.

[15]李治，何文山，劉春萍，等.乳腺癌干細胞放療反應性和耐受機制的研究[J］.中華實驗外科雜志，2010，27(6):697-698.

[16]Chang CJ，Hsu CC， Yung MC， etal. Enhanced radiosensitivity and radiation-induced apoptosis in glioma CD133-positive cells by knockdown of SirT1 expression[J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，380(2):236-242.

[17]Horsman MR，Siemann DW， Chaplin DJ， et al.Nicotinamide as a radiosensitizer in tumours and normal tissues:the importance of drug dose and timing[J］.Radiother Oncol，1997，45(2):167-174.

[18]Marchetti F，Coleman MA，Jones IM，et al.Candidate protein biodosimeters of human exposure to ionizing radiation[J］.Int J Radiat Biol，2006，82(9):605-639.

[19]任瑞平，何明遠，邵春林.DNA損傷修復相關蛋白H2AX，ATM，CDKN1A，TP53輻射響應研究現狀[J］.輻射防護通訊，2011，31(1):32-35.

[20]Bao S，Wu Q，McLendon RE，et al.Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response[J］.Nature，2006，444(7120):756-760.

[21]王會平，周平坤.組蛋白H2AX與DNA損傷的分子感應[J］.癌變·畸變·突變，2006，18(4):334-336.

[22]Wu CY，KangHY，YangWL，etal.Criticalroleof monoubiquitination of histone H2AX protein in histone H2AX phosphorylation and DNA damage response[J］.J Biol Chem，2011，286(35):30806-30815.

[23]Rothkamm K，Lobrich M.Evidence for a lack of DNA doublestrand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses[J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(9):5057-5062.

[24]Booher RN，Alfa CE，Hyams JS，et al.The fission yeast cdc2/cdc13/suc1 protein kinase:regulation of catalytic activity and nuclear localization[J］.Cell，1989，58(3):485-497.

[25]Al-Assar O，MuschelRJ，MantoniTS，etal.Radiation response of cancer stem-like cells from established human cell lines after sorting for surface markers[J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2009，75(4):1216-1225.

[26]董雪濤.腦腫瘤干細胞與小生境[J］.國際神經病學神經外科學雜志，2010，37(6):565-569.

[27]李明武，牛朝詩.腦腫瘤干細胞的分布與腫瘤微血管的相關性[J］.中華醫學雜志，2010，90(5):305-309.

[28]Keith B，Simon MC.Hypoxia-inducible factors，stem cells，and cancer[J］.Cell，2007，129(3):465-472.

[29]Platet N，Liu SY，Atifi ME，et al.Influence of oxygen tension on CD133 phenotype in human glioma cell cultures[J］.Cancer Lett，2007，258(2):286-290.

[30]Xing F，Okuda H，Watabe M，et al.Hypoxia-induced Jagged2 promotes breast cancer metastasis and self-renewal of cancer stem-like cells[J］.Oncogene，2011，30(39):4075-4086.

[31]Oliveira LR，Oliveira-Costa JP，Soave DF，et al.Cancer stem cell immunophenotypes and hypoxia-inducible factor-1alfa influences on oral squamous cell carcinoma[J］.Oral Oncol，2011，471:S131.

[32]Mitchell JB，Russo A.The role of glutathione in radiation and drug induced cytotoxicity[J］.Br J Cancer Suppl，1987，8:96-104.

[33]Croker AK，Allan AL.Inhibition of aldehyde dehydrogenase(ALDH)activityreduceschemotherapyand radiation resistance of stem-like ALDH(hi)CD44(+)human breast cancer cells[J］.Breast Cancer Res Treat，2012，133(1):75-87.