殼聚糖 /肝素雷帕霉素藥物洗脫支架對豬冠狀動脈早期快速內皮化及抗血栓的作用*

郜俊清，金惠根，嚴鵬勇，張文全，武前福，劉宗軍

·基礎與實驗研究·

殼聚糖 /肝素雷帕霉素藥物洗脫支架對豬冠狀動脈早期快速內皮化及抗血栓的作用*

郜俊清，金惠根，嚴鵬勇，張文全，武前福，劉宗軍

目的：明確殼聚糖 /肝素雷帕霉素藥物洗脫支架（LBL-PLA-RAP 支架）對豬冠狀動脈（冠脈）早期快速內皮化及抗血栓的作用。

藥物洗脫支架；層層自組裝；殼聚糖 /肝素；內皮化；血栓；

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:218.)

藥物洗脫支架可顯著降低冠狀動脈（冠脈）介入治療再狹窄率的發生，但是支架內皮化不良、支架晚期血栓形成是經皮冠脈介入術的突出問題[1-3]。有研究表明，藥物洗脫支架置入后可出現支架內血栓、聚合物高敏反應、支架貼壁不良、動脈瘤等并發癥[4-6]，而支架內血栓尤其是晚期支架內血栓是藥物洗脫支架最嚴重的并發癥，已引起國內外學者的高度重視。研究顯示，目前臨床應用的主要藥物洗脫支架 (如雷帕霉素和紫杉醇洗脫支架 )在置入血管后存在支架內皮化延遲，并可能是晚期支架內血栓形成的主要原因[7-10]。目前改善藥物洗脫支架早期內皮化的方法仍主要為藥物洗脫支架涂層膜的改性及所載物質的選擇[11-15]。本課題組在前期研究[16]中成功地將殼聚糖/肝素層層自組裝涂層膜應用于裸金屬支架表面，并表現出強大的抗血栓及促進早期內皮化作用，該涂層膜是自主研發研究結果，已形成發明專利（專利號：200710045639.1）。本次研究是將殼聚糖/肝素層層自組裝涂層膜應用于雷帕霉素藥物洗脫支架中，望研究出一種具備抗血栓及促進早期內皮化安全有效的藥物洗脫支架。

1 資料與方法

殼聚糖 /肝素雷帕霉素藥物洗脫支架（LBLPLA-RAP 支架 ）的制備：將 316 L 不銹鋼冠脈金屬裸支架（18 mm×2.5 mm～3 mm）（微創醫療器械有限公司提供，中國 ）沉浸在酒精 /水（1:1）中作用 4 h，以除去油性污垢，然后用去離子水清洗，30℃減壓烘干 24 h。將清洗后的裸金屬支架沉浸在 3- 氨丙基乙醇溶液（購自 Acros Organics 公司，比利時 ）4 h，然后用去離子水清洗，50℃常壓烘干清洗后的裸金屬支架沉浸在一個含 0.1%乙醇的3 - 氨丙基溶液（APTES，購自 Acros Organics 公司，比利時）中 37℃ 4 h，然后用去離子水沖洗，并在50℃空氣干燥。經處理的支架置入 0.01 M 鹽酸中 2 h，再用大量的水沖洗。然后，將支架浸泡在 0.1%肝素鈉鹽水溶液（高能物理研究化工有限公司）15 min，隨后用純凈水沖洗。隨后將肝素支架置入 0.2% 乙酸與 0.1% 殼聚糖（購自西格瑪公司 ）混合溶液中 15 min，再次進行漂洗。反復進行上述涂層沉積，產生一個穩定靜電相互吸引作用的復合膜。最后將殼聚糖肝素支架于 30℃減壓烘干 48 小時，制備成殼聚糖 /肝素涂層膜支架（LBL 支架），該支架為自主研發，已形成發明專利（專利號：200710045639.1）。將聚乳酸與雷帕霉素 1:1 混合，將殼聚糖 /肝素涂層膜支架采用滾涂法涂抹于支架外表面，以直徑每cm 支架 50 μg 雷帕霉素藥物含量均勻涂抹于支架表面，制備成非對稱型 LBL-PLA-RAP 支架（血液面為殼聚糖/肝素涂層，血管壁面為聚乳酸與雷帕霉素），最后以 30℃減壓烘干 48 h。

實驗動物及術前準備：所有動物實驗經上海中醫藥大學動物保護利用委員會批準。實驗動物為廣西小香豬 9只（25公斤，6月齡，于2010-12 購自上海動物管理中心）。所有動物進行常規飼料喂養，其中 6 只每天給予 300 mg 阿司匹林及 150 mg 氯吡格雷抗血小板聚集，另外3只不給與抗血小板藥物干預。動物實驗前一夜禁食，采用 0.5 mg/kg 氯胺酮及 0.5 mg/kg 地西泮誘導麻醉，氣管插管保持氣道通暢，采用戊巴比妥鈉靜脈麻醉。

動靜脈分流模型：本實驗豬均經阿司匹林及氯吡格雷抗血栓作用。無菌條件下，分離豬股動脈及股靜脈，采用消毒后的 30 cm×3 mm皮管鏈接動靜脈，形成動脈靜脈循環，將 LBLPLA-RAP 支架、LBL 支架與裸金屬支架于皮管內擴張，每種支架重復3個樣本，使用3只小香豬進行實驗，每只小香豬中放入不同組的3個支架，每支血管置入1枚支架，將血液灌流，血流控制在 90 ml/ min，灌流 60 min，隔開管道，取出支架，所有樣品經干燥進行稱重、光鏡比較。

高血栓負荷模型：本實驗豬未經阿司匹林及氯吡格雷抗血栓作用。將 LBL-PLA-RAP 支架、LBL 支架與裸金屬支架經 12 個大氣壓進行擴張置入豬冠脈，每種支架重復3個樣本，使用3只小香豬進行實驗，每只小香豬中放入不同組的3個支架，每支血管置入1枚支架，根據心電圖 ST 段變化及每相隔 10 min 進行冠脈造影，并通過血管內超聲明確血栓形成，觀察比較不同支架形成血栓的時間。

球囊損傷模型：本實驗豬均經阿司匹林及氯吡格雷抗血栓作用。從股動脈途徑進行冠脈造影，通過定量冠脈造影選取冠脈直徑在 2.5～3.5 mm 的血管，隨機選取支架，通過 0.014 導絲將支架置入冠脈，以球囊擴張，平均 12個大氣壓，擴張 8 秒，擴張比例以擴張直徑：血管直徑 1.1:1的比例進行過度擴張，緩慢撤出球囊，重復冠脈造影，然后緩慢撤出導管，股動脈修復，縫合皮膚。使用3只小香豬進行實驗，每只小香豬中放入不同組的 3 個支架（LBL-PLA-RAP 支架、LBL 支架、裸金屬支架），每支血管置入 1 枚支架，所有豬術后每日服用阿司匹林 300 mg 及氯吡格雷 150 mg 抗血小板治療，1 周后復查冠脈造影。

組織制備：冠脈支架于第7天取出，每個支架被平均切成 3 段。1 段經 10% 緩沖福爾馬林固定后，硬樹脂包埋，再經硬組織切片機切片（德國萊卡切片機），經蘇木素伊紅染色，測定血管面積及組織學分析。1段經 1% 戊二醛固定，樣本經冷凍干燥，采用掃描電子顯微鏡觀察（掃描電鏡，TS 5136 MM, Tescan Ltd.）。另 1 段經免疫組化固定液固定（購自碧云天公司），通過 CD31 免疫熒光抗體（購自 Abcam 公司）進行免疫組化，通過激光共聚焦（購自 LEICA 公司）觀察冠脈支架。

統計學分析：所有數據采用 SPSS17.0 軟件進行統計分析。若P＜0.05 則認為數據間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動靜脈分流實驗

所有的裸金屬支架在不足1小時出現支架內血流堵塞，而所有的 LBL-PLA-RAP 支架管腔內仍保持通暢。取出支架，用磷酸鹽緩沖液輕柔沖洗支架，50℃常壓烘干，見裸金屬支架表面滿覆血栓，而LBL-PLA-RAP 支架表面基本無血栓。稱重，LBLPLA-RAP 支 架血 栓重量為（0.40±0.11）mg，LBL支架血栓重量為（0.46±0.06）mg，比裸金屬支架血栓重量（9.46±2.75）mg 均低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。表1

表1 三種支架在動靜脈分流模型、高血栓負荷模型及 CD31 熒光染色定量分析中的比較（±s）

2.2 高血栓負荷實驗

裸金屬支架在（59.0±8.5）min 出現支架血栓，與 LBL-PLA-RAP 支架和 LBL 支架在 360 min 內未出現支架血栓比，差異均有統計學意義（P＜0.05）。表1

2.3 球囊損傷實驗

在置入支架后的第7天，復查冠脈造影，各組均無支架內再狹窄發生。處死實驗豬，取出支架段冠脈，橫斷面切片經蘇木素伊紅染色后，LBLPLA-RAP 支架、LBL 支架與裸金屬支架均無狹窄發生，也無明顯內皮剝脫現象（圖1A、1B、1C）。

圖1 支架段冠脈橫斷面切片圖片。1A：LBL-PLA-RAP 支架 1B：LBL 支架 1C：裸金屬支架

另取一段經戊二醛固定后，掃描電鏡觀察支架內皮化，裸金屬支架表面已經內皮化（圖2 C），但 1000 倍掃描電鏡顯示內皮細胞呈圓形生長，而LBL-PLA-PAR 支架（圖2 A）與 LBL 支架（圖2B）表面已經完全內皮化，1000 倍掃描電鏡顯示內皮細胞呈梭形順血流方向生長。

圖2 電鏡觀察支架 內 皮化圖片。2A：LBL-PLA-RAP 支架 2B：LBL 支架2C：裸金屬支架

獲取冠脈支架后另取一段冠脈支架，將支架浸泡于專用免疫組化固定液（購自碧云天公司）中，剪開并平鋪支架，用 CD31 抗體對支架進行免疫熒光染色，采用激光共聚焦檢測，Image-Pro Plus 6.0 軟件進行定量分析，結果顯示 LBL-PLA-RAP 支架內皮覆蓋率為（82.7±16.4）%(圖3A)，LBL 支架內皮覆蓋率為（80.7±14.1）%(圖3B)，比裸金屬支架內皮覆蓋率（64.3±11.0）%(圖3C)均高，差異均有統計學差異（P＜0.05）。表1

圖3 免疫熒光染色圖片。3A：LBL-PLA-RAP 支架 3B：LBL 支架 3C：裸金屬支架

3 討論

在本次研究中，我們首次采用支架雙面不對稱涂層法將殼聚糖/肝素涂層膜應用于雷帕霉素藥物洗脫支架。滾涂法涂層與一般噴涂法比較，可將支架進行單面涂層，達到支架血液表面與組織表面功能性的差異。本研究通過涂層膜對于內皮的“高親和力”，達到早期促進內皮化，抗血栓生成的效果。支架的內皮修復是血管修復的關鍵一步，支架表面內皮早期遷移修復可以有效降低血栓的形成。

LBL-PLA-RAP 支架在體外動靜脈分流模型中，LBL-PLA-RAP 支架與 LBL 支架具有相似的抗血栓作用，2 h 內，支架表面幾乎沒有支架血栓粘附，而裸金屬支架表面滿布血栓。在高負荷體內血栓模型（在未經氯吡格雷及阿司匹林抗血小板聚集的實驗豬）實驗中，LBL-PLA-RAP 支架與 LBL 支架在置入支架后 360 min 內未出現支架血栓表現，而裸金屬支架在 59 min 時就出現支架血栓。該實驗更符合人體支架血栓形成的規律，進一步明確 LBL-PLARAP支架具有良好的抗血栓作用。

在1周的整體動物模型中，三種支架均未出現再狹窄，且沒有明顯的炎癥改變，而讓人感到高興的是，LBL-PLA-RAP 支架在 1 周時就已經幾乎完全內皮化，掃描電鏡結果顯示 LBL-PLA-RAP 支架表面已經覆蓋了一層梭形順血流方向生長的內皮細胞，而裸金屬支架雖也已覆蓋了內皮細胞，但是細胞形態仍略劣于 LBL-PLA-RAP 支架。本研究，采用激光共聚焦檢測，支架表面內皮細胞 CD31的表達，結果同樣證實 LBL-PLA-RAP 支架表面幾乎完全內皮化，在定量分析報告中也說明，其較裸金屬支架有更好的內皮親和力，具備早期快速促進內皮的功能。

層層自組裝殼聚糖/肝素涂層膜，已廣泛應用于醫學生物學的多個領域，本課題組在以往研究[16]中，首次將該涂層膜應用于裸金屬支架，發現其具備強大的抗血栓及促內皮化效果。本次研究課題組又將該涂層膜應用于雷帕霉素藥物洗脫支架，在確保藥物洗脫支架良好藥物釋放的同時，保留涂層膜強大的抗血栓及促內皮化的效果。該研究為臨床前研究，目前結果顯示該藥物支架有良好的臨床應用前景。

結論： LBL-PLA-RAP 支架具有良好的藥物釋放曲線，并在動靜脈分流模型、高血栓負荷模型及1周動物實驗中證實其仍具有強大的抗血栓及能夠在極早期促進支架內皮化。

致謝：這個項目是由上海市醫學重點專科建設項目、上海市普陀區自主創新重大項目，上海市教委項目資助完成。

[1]Brodie B, Pokharel Y, Fleishman N, et al.Very late stent thrombosis after primary percutaneous coronary intervention with bare-metal and drug-eluting stents for ST-segment elevation myocardial infarction: a 15-year single-center experience. JACC Cardiovasc Interv，2011, 4: 30-38.

[2]Blich M, Zeidan-Shwiri T, Petcherski S, et al. Incidence, predictors and outcome of drug-eluting stent thrombosis in real-world practice. J Invasive Cardiol, 2010, 22: 461-464.

[3]Holmes DR, Kereiakes DJ, Garg S, et al. Stent thrombosis. J Am Coll Cardiol， 2010, 56: 1357-1365.

[4]Iakovou I, Schmidt T, Bonizzoni E, et al. Incidence, predictors, and outcome of thrombosis after successful implantation of drug-eluting stents. JAMA, 2005, 293: 2126-2130.

[5]Ong AT, McFadden EP, Regar E, et al. Late angiographic stent thrombosis (LAST) events with drug-eluting stents. J Am Coll Cardiol, 2005, 45: 2088-2092.

[6]McFadden EP, Stabile E, Regar E, et al. Late thrombosis in drugeluting coronary stents after discontinuation of antiplatelet therapy. Lancet, 2004, 364: 1519-1521.

[7]Virmani R, Kolodgie FD, Farb A, et al. Drug eluting stents: are human and animal studies comparable ？ Heart, 2003, 89: 133-138.

[8]VirmaniR, Guagliumi G, FarbA, et al. Localized hypersensitivcty and late coronary thrombosis secondary to asirolimus-eluting stent: should we be cautious? Circulation, 2004,109:701-705.

[9]Joner M, Finn AV, Farb A,et al. Pathology of drug-eluting stents in humans: delayed healing and late thrombotic risk. J AM Coll Cardiol, 2006,48:193-202.

[10]Oyabu J, Ueda Y, Ogasawara N, et al. Angioscopic evaluation of neointima coverage: sirolimus drug-eluting stent versus bare metal stent. Am Heart J, 2006,152:1168-1174.

[11]Jia H, Liu H, Kong J,et al. A novel polymer-free paclitaxel-eluting stent with a nanoporous surface for rapid endothelialization and inhibition of intimal hyperplasia: Comparison with a polymer-based sirolimus-eluting stent and bare metal stent in a porcine model. J Biomed Mater Res A， 2011, 98:629-637.

[12]Nakazawa G, Granada JF, Alviar CL,et al. Anti-CD34 antibodies immobilized on the surface of sirolimus-eluting stents enhance stent endothelialization. JACC Cardiovasc Interv， 2010, 3: 68-75.

[13]Larsen K, Cheng C, Tempel D,et al. Capture of circulatory endothelial progenitor cells and accelerated re-endothelialization of a bioengineered stent in human ex vivo shunt and rabbit denudation model. Eur Heart J， 2012, 33:120-128.

[14]竇克非，徐波，楊躍進，等 . TIVOLI 完全可降解涂層西羅莫司洗脫支架與 ENDEAVOR 佐他莫司洗脫支架的臨床隨訪結果 . 中國循環雜志 , 2012,27：334-337.

[15]邱洪，羅彤，胡小瑩，等 .新型生物可降解聚合物雷帕霉素靶向洗脫支架預防支架內狹窄的動物實驗研究 . 中國循環雜志，2012，27: 220-223.

[16]Meng S, Liu Z, Shen L,et al. The effect of a layer-by-layer chitosanheparin coating on the endothelialization and coagulation properties of a coronary stent system. Biomaterials， 2009, 30: 2276-2283.

Effect of Chitosan/Heparin Rapamycin Drug Eluting Stent on Accelerating the Early Phase Re-Endothelialization and Anti-Thrombus Properties in Porcine Coronary Artery

GAO Jun-qing, JIN Hui-gen, YAN Peng-yong, ZHANG Wen-quan, WU Qian-fu, LIU Zong-jun.

Department of Cardiology, Central Hospital of Shanghai Putuo District, Shanghai (200062), China Corresponding Author: LIU Zong-jun, Email: kevingjq@163.com

Objective: To clarify the effect of chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent on accelerating the in-stent early phase re-endothelialization and anti-thrombus properties in porcine coronary artery.Methods: A total of 9 small pigs were divided into 3 models, Arterio-venous shunt model, High thrombosis load model, and coronary artery balloon injury model. n=3 in each model. Each animal was implanted in 3 stents as chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent, chitosan/heparin coating stent, and bare metal stent. The anti-thrombus effect of chitosan/ heparin rapamycin drug eluting stent was examined with Arterio-venous shunt and High thrombosis load models, the early phase re-endothelialization effect of chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent was evaluated with 1 week-coronary artery balloon injury model.Results: Compared with bare metal stent, chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent presented the better antithrombus effect in Arterio-venous shunt and High load thrombosis models, it also showed better re-endothelialization effect in 1 week-coronary artery balloon injury model of animals.Conclusion: Chitosan/heparin rapamycin drug eluting stent has strong in-stent anti-thrombus effect and may improve the early phase re-endothelialization in experimental porcine coronary artery.

Drug eluting stent; Layer-by-layer self-assembly; Chitosan/heparin; Endothelialization; Thrombus

2012-09-10）

（編輯：王寶茹）

*

上海市醫學重點專科心內科 (05-II026)；上海市普陀區自主創新項目（B82）

200062 上海市普陀區中心醫院 心內科

郜俊清 住院醫師 碩士研究生 主要從事冠心病介入治療的基礎研究 Email:kevingjq@sina.com

劉宗軍 Email:kevingjq@163.com

R54

A

1000-3614（2013）03-0218-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.03.017

方法：共選取9只小香豬，每種模型（靜脈分流模型、高血栓負荷模型、球囊損傷模型）用3只小香豬，每只豬冠脈內分別置入 3 種不同的支架（LBL-PLA-RAP 支架、殼聚糖 /肝素涂層膜支架、裸金屬支架）。通過動靜脈分流模型與高血栓負荷模型驗證 LBL-PLA-RAP 支架的抗血栓作用，通過 1 周豬冠脈球囊損傷模型，觀察 LBL-PLARAP支架早期內皮化的作用。

結果：LBL-PLA-RAP 支架在動靜脈分流模型與高血栓負荷模型中較裸金屬支架有較好的抗血栓作用，且在 1 周的球囊損傷模型中顯示較好的內皮化作用。

結論：LBL-PLA-RAP 支架具有強大的抗血栓及能夠在極早期促進支架內皮化。