溶血磷脂酸對心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用及機制*

楊晉靜 , 陳海波 , 王憲云 , 范雪松 , 叢祥鳳 , 陳曦

溶血磷脂酸對心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用及機制*

楊晉靜 , 陳海波 , 王憲云 , 范雪松 , 叢祥鳳 , 陳曦

目的：探討溶血磷脂酸 (LPA)對心肌細胞缺氧 /復氧誘導損傷的保護作用及機制。

溶血磷脂酸；缺氧 /復氧；心肌細胞

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:222.)

缺血再灌注損傷常見于急性心肌梗死、冠狀動脈旁路移植術、心臟移植，是心血管疾病臨床治療中面臨的重要難題。缺血再灌注損傷導致的缺血周邊區心肌細胞的凋亡會導致心肌收縮力減低，心功能障礙，嚴重的甚至發生急性心力衰竭[1,2]。因此，探索防治缺血再灌注損傷的保護藥物成為心血管疾病研究領域的熱點[3]。

溶血磷脂酸 (LPA)是一種內源性的生物活性脂質分子，通過特異的G蛋白耦聯受體調節廣泛的生物學功能[4]。本研究組以前發現心肌梗死患者血清LPA 水平顯著升高[5]，并指出 LPA 可能通過促進心肌細胞肥大及成纖維細胞增殖參與了心肌梗死后的心 室重 塑[6,7]。Liu 等[8]還 發 現 LPA 能 顯 著 抑 制 無血清缺氧誘導的骨髓間充質干細胞凋亡。國外報道LPA 對缺血或缺血再灌注誘導的器官或細胞損傷也具有保護作用[9,10]。因此，推測 LPA 可能對缺血再灌注導致的心肌細胞損傷具有保護作用。本文以缺氧復氧誘導的 H9c2 心肌細胞為模型，模擬心肌缺血再灌注損傷，研究 LPA 對 H9c2 心肌細胞缺氧 /復氧損傷的影響及機制。

1 材料與方法

試劑：H9c2 心肌細胞株購自中國醫學科學院細 胞 庫。DMEM 培 養 液 和 胎 牛 血 清 購 自 美 國 Life Technologies公司；抗甘油醛 -3- 磷酸脫氫酶 (GAPDH)抗 體 購 自 美 國 Sigma 公 司；缺 氧 催 化 劑 購 自法 國BioMerieux 公 司；Hoechst33342 購 自 中杉金 橋 公司；LPA3 受 體 特 異 激 動 劑 OMPT(1-oleoyl-2-Omethylrac-glycero-phosphothionate)和 LPA 購 自 美 國 Avanti公司；細胞活性檢測 (MTS)試劑盒和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 -3/7（Caspase 3/7）活性檢測試劑盒購自美 國 Promega 公 司；抗 Caspase-3 抗 體， 抗 cleavedcaspase-3 抗體，抗 Bcl-2 抗體和抗 Bax 抗體均購自美國 Cell Signaling Technologies 公司。

細胞培養及實驗分組：本實驗開始于 2012-09 到2013-01 結束。原代 SD 乳鼠心肌細胞的分離培養按照本實驗室以前建立的方法進行[7]。取出生后 1～3 天的 SD 乳鼠心臟，用 0.08% 胰酶消化分離，差速貼壁培養 1 h 棄除成纖維細胞，將心肌細胞在含 10% 胎牛血清（FBS）和 100 μM Brdu 的 DMEM 中培養。而H9c2 心肌細胞株在含 10% 胎牛血清 DMEM 培養基，37℃和 5% CO2條件下培養。2～3 天傳代 1 次。心肌細胞融合達到 70%～80% 時隨機分組： 對照組：細胞置于 95% 空氣，5%CO2，持續培養 24 h，不加任何處理；缺氧 /復氧 (H/R)組：換無血清 DMEM 培養液，將細胞迅速放入密閉缺氧罐中，缺氧 24 h 后，換含 10%胎牛血清的 DMEM 培養液常氧條件下培養 3 h； LPA預處理 (H/R+LPA) 組和 LPA3 受體特異激動劑（OMPT）預處理（H/R+OMPT）組：細胞用不同濃度 LPA (1, 10, 25 μΜ) 或 OMPT(1，5，10 μM) 處理 1 h，然后進行缺氧 /復氧處理，缺氧過程中 LPA 或 OMPT持續存在，復氧過程中不加 LPA 和 OMPT。

臺盼藍染色：0.4% 的臺盼藍與細胞懸液以 1:1混勻，在 3 min 內用血球計數板在顯微鏡下分別計數活細胞數和死細胞數：

活細胞數 ( % ) = [活細胞總數 / ( 活細胞總數 +死細胞總數 ) ]× 100%

細胞活性檢測：細胞按 1× 104個 /孔接種于 96孔板中，每孔 100 μl。實驗結束后，直接加入 MTS反應液 20 μl/孔，繼續在 5%CO2，37℃培養箱中培養 2 h，然后迅速用酶標儀在 490 nm 波長處檢測吸光度值。不加細胞的培養基作為空白對照，實驗結果以細胞存活率表示。

Caspase-3/7 活性檢測：Caspase-3/7 活性測定采用 Caspase-3/7 活性分析試劑盒。細胞計數后，將細胞懸液調整到 4×104個細胞 /mL，在不透明的白色 96 孔板的待測各孔添加 50 μl細胞 Caspase-3/7緩沖液和 Caspase-3/7 底物混合液，室溫，孵育 2 h，孵育后的樣品板放入 VeritasTM 發光檢測儀檢測。

免疫印跡檢測：實驗處理完成的心肌細胞，收集 總 蛋 白， 冰 上 裂 解 30 min [1%TritonX-100, 20 mmol/L HEPES, 5 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L 乙 二 胺四乙酸 , 1 mmol/L 乙二醇 - 雙 -（2- 氨基乙醚 ）四乙酸 , 1 mmol/L 二硫蘇 糖醇 , 1 mmol/L 苯 甲基磺 酰氟 , 1 mmol/L Na3VO4, 10 μg/ml leupeptin, 10μg/ml aprotinin, 10μg/ml pepstatin]。 測 蛋 白 濃 度， 取 30 μg 蛋白， 進行 4%～10%SDS-PAGE 凝膠電 泳后，轉移到硝酸纖維素膜，用含 5% 的脫脂牛奶的 TBST封閉 1 h，一抗 4℃孵育過夜，次日洗膜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育 1 h, 然后壓片顯影。

流式細胞術檢測：細胞經胰酶消化，800 rpm，4℃，離心 6 min，PBS 洗 1～2 次，每個樣品加入 200 μl binding buffer 和 10 μl Annevin V， 避 光 反 應 30 min，加入 300 μl binding buffer 和 10 μl PI，5 min 內流式細胞儀檢測。活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞及壞死細胞分別標記為 Annevin V-/PI-，Annevin V+/PI-，Annevin V+/PI+， Annevin V-/PI+。

統計學處理：所有數據均以均數±標準差表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

LPA 抑制缺氧 /復氧誘導的 H9c2 心肌細胞損傷結果：H9c2 心肌細胞臺盼藍染色和 MTS 檢測存活率結果顯示：H/R 組 H9c2 心肌活細胞數和 H9c2 心肌細胞存活 率較對照組明 顯減低 (P 均 ＜0.05)，H/R + LPA 組 H9c2 心肌活細胞數和 H9c2 心肌細胞存活率（25 μM 濃度除外 ）與 H/R 組相比均顯著提高（P均 ＜0.05），圖1A、1B)。另外 MTS 檢測原代乳鼠心肌細胞存活率結果顯示：H/R 組原代乳鼠心肌細胞存活率 較對 照組 下降 (P＜0.05)， H/R+LPA 10 μM 組 原代乳鼠心肌細胞存活率較 H/R 組明顯提高 (P＜0.05，圖1C)。流式細胞術檢測 H9c2 心肌細胞凋亡結果顯示：H/R 組早期 H9c2 心肌凋亡細胞比例較對照組顯著 增 加 (P＜0.05)，H/R+LPA 組 10 μM 早 期 H9c2 心肌凋亡細胞比例較 H/R 組顯著降低 (P＜0.05，圖2)。

圖1 溶血磷脂酸抑制缺氧 /復氧誘導的 H9c2 心肌細胞損傷。 1A： 臺盼藍染色計數 H9c2 心肌細胞活細胞數 1B： MTS 檢測 H9c2 心肌細胞存活率1C：MTS 檢測原代乳鼠心肌細胞存活率 1：對照組 2：缺氧／復氧組 3：缺氧／復氧＋ LPA1μM 4：缺氧／復氧＋ LPA10μM 5：缺氧／復氧＋ LPA25μM。與對照組相比*P＜0.05 與缺氧 /復氧組相比△P＜0.05 圖2 流式細胞術檢測 H9c2 心肌細胞早期凋亡比例圖。 與對照組相比*P＜0.05；與缺氧 /復氧組相比△P＜0.05。1：對照組 2：缺氧 /復氧組 3：缺氧 /復氧 +LPA10 μM

LPA 通過調節線粒體凋亡途徑抑制缺氧 /復氧誘導的 H9c2 心肌細胞損傷：Caspase-3/7 活性檢測結果顯示： H/R 組 Caspase-3/7 活性較對照組明顯增加 (P＜0.05)。H/R+LPA 組 兩 個 濃 度 (LPA 1,10 μM) H9c2 心肌細胞的 Caspase-3/7 活性較 H/R 組顯著降低 (P＜0.05，圖3)。免疫印跡檢測結果顯示：H／R組較對照組心肌細胞裂解的 Caspase-3 的蛋白表達水平明顯增高（P＜0.05)。H/R+LPA 組 10 μM 濃度的心肌細胞裂解的 Caspase-3 的蛋白表達水平較 H/R組明顯降低 (P＜0.05，圖4)。

LPA3 受體激活調節線粒體凋亡蛋白抑制缺氧 /復氧誘導的 H9c2 心肌細胞損傷：由于缺乏 LPA 受體特異的抑制劑，本研究用 OMPT 研究介導 LPA 抗缺氧 /復氧誘導 H9c2 心肌細胞損傷的受體亞型。結果顯示：H/R+OMPT 組三個濃度較 H/R 組線粒體促凋亡Bax 蛋白表達都減少，線粒體抗凋亡 Bcl-2 蛋白表達都增加 (P＜0.05～0.01)，差異均有統計學意義 (圖5)。

圖3 LPA 對缺氧 /復氧誘 導 的 H9c2 心 肌 細 胞Caspase-3/7 活性的影響。與 對 照 組 相 比*P＜0.05；與 缺 氧 /復 氧組 相 比△P＜0.05。余注見圖1 圖4 免疫印跡檢測 LPA 對缺氧 /復氧誘導的 H9c2 心肌 細 胞 裂 解 的 Caspase-3蛋 白 的 影響。4A:免 疫印 跡 檢 測 Caspase-3 前體 和 裂 解 的 Caspase-3的 蛋 白 水 平。4B：Cl.caspase-3 相對 表達量柱 狀 圖 LPA：溶 血 磷 脂酸 Procaspase-3: Caspase-3前 體 Cl.caspase-3：裂 解的 Caspase-3。 與 對 照 組相 比*P＜0.05；與 缺 氧 / 復氧組相比△P＜0.05。 1：對照組 2：缺氧／復氧組 3：缺氧／復氧＋LPA1μM 4：缺氧／復氧＋ LPA5μM 5：缺氧／復氧＋ LPA10μM

圖5 OMPT 對缺氧 /復氧誘導的 H9c2 心肌細胞線粒體凋亡蛋白 Bcl-2 和 Bax的影響。5A:免疫印跡檢測 Bax 蛋 白、Bcl-2 蛋 白水 平 5B：Bax 蛋 白 表 達水 平 柱 狀 圖 5C: Bcl-2蛋白表達水平柱狀圖 與對照 組 相比*P＜0.05；與 缺氧 /復 氧 組 相 比△P＜0.05△△P＜0.01。 OMPT：LPA3受體激動 劑 GAPDH：甘油醛-3- 磷酸脫氫酶。1：對照組 2：缺氧／復氧組 3：缺氧／復氧＋OMPT1μM 4：缺氧／復氧＋OMPT5μM 5：缺氧／復氧＋ OMPT10μM

3 討論

溶血磷脂酸是一種內源性的生物活性脂質分子，主要來源于血液中應激的血小板[11]。LPA 通過 G 蛋白耦聯受體調節廣泛的細胞學功能。本課題組早期的研究發現心肌梗死患者血清中 LPA 水平顯著升高[5]。并在動物實驗研究中指出：早期重塑過程中，LPA3 受體表達明顯上調，并且LPA 可以通過LPA3 受體介導的信號促進心肌細胞肥大以及成纖維細胞的增殖[6,7]，表明LPA-LPA3信號可能在心肌梗死后的心室重塑中扮演著重要角色。同時我們還發現LPA顯著減少無血清缺氧誘導的骨髓間充質干細胞凋亡。本研究首次報道LPA信號在缺血再灌注誘導的心肌細胞損傷中的保護作用。我們發現缺氧 /復氧導致 H9c2 和原代乳鼠心肌細胞出現明顯的損傷，細胞存活率明顯降低。而LPA預處理后，明顯減少了缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷，提高細胞存活率，并減少早期凋亡細胞數。線粒體是調節細胞凋亡的中心。抗凋亡 Bcl-2 和促凋亡 Bax 是線粒體凋亡途徑中兩個關鍵的基因。前者通過調節線粒體細胞色素 C 的釋放抑制凋亡執行者 caspase-3 激活，而后者調節細胞色素 C 釋放后則激活 caspase-3。本研究發現缺氧 /復氧誘導的 H9c2 心肌細胞具有活性的 Caspase-3 和裂解的 Caspase-3 蛋白表達，明顯被 LPA 預處理抑制，提示LPA通過調節線粒體凋亡途徑發揮其保護作用。重要的是，LPA3受體激動劑OMPT預處理明顯抑制缺氧 /復氧誘導的 H9c2 心肌細胞 Bax的蛋白表達，并提高了 Bcl-2 的蛋白表達，表明 LPA3 受體的激活參與了LPA在心肌細胞缺氧/復氧損傷中的保護作用，同時表明 LPA 的確通過抑制線粒體凋亡途徑，抗缺氧復氧誘導的 H9c2 心肌細胞損傷。 LPA3 受體激動劑 OMPT 預處理明顯提高了 Bcl-2/Bax 比值，表明 LPA3 受體的激活可能通過抑制線粒體凋亡途徑，從而抗缺氧復氧誘導的H9c2心肌細胞損傷。原代心肌細胞培養過程復雜，耗時，耗力，同時貼壁性強，不適合進行流式細胞凋亡檢測，胚胎心肌細胞 H9c2 已成為代替原代心肌細胞進行缺氧或缺氧/復氧實驗研究的一種廣泛使用的心肌細胞株。同時我們在原代乳鼠心肌細胞的細胞活力檢測中發現LPA的確提高缺氧復氧誘導的原代乳鼠心肌細胞存活率，這一結果有力的支持了LPA在缺氧/復氧誘導的心肌細胞損傷中的保護作用。作為磷脂類分子的代表之一，LPA 分子小，結構簡單，易透過細胞膜 , 這些特性賦予其將來作為小分子藥物的可能。特別需要指出的是，與LPA 類似的脂質分子-1-磷酸鞘氨醇 (SIP)治療多發性硬化疾病，已經進入臨床Ⅲ期試驗，這提示磷脂類分子可能是一種具有應用前景的新型治療藥物。我們的研究僅在細胞水平探討了LPA對心肌細胞缺氧復氧損傷的保護作用，進一步的整體動物實驗在將來的研究需要證實。

[1]Sabbah HN. Apoptotic cell death in heart failure. Cardiovasc Res ，2000，45:704-712.

[2]趙亞玲 ,敖虎山 . 心肌缺血再灌注損傷的研究進展 .中國循環雜志 ,2011， 5:396-398.

[3]張昱 ,程衛平 . 硫化氫對乳鼠心肌細胞缺氧—復氧損傷的保護作用 . 中國循環雜志 ,2009， 3:227-230.

[4]Mutoh T, Rivera R, Chun J. Insights into the pharmacological relevance of lysophospholipid receptors. Br J Pharmacol， 2012， 165:829-844.

[5]Chen X, Yang XY, Wang ND, et al. Serum lysophosphatidic acid concentrations measured by dot immunogold filtration assay in patients with acute myocardial infarction. Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation， 2003，63:497-504.

[6]Chen J, Han Y, Zhu W, et al. Specific receptor subtype mediation of lpa-induced dual effects in cardiac fibroblasts. FEBS Lett ，2006，580:4737-4745.

[7]Chen J, Chen Y, Zhu W, et al. Specific lpa receptor subtype mediation of lpa-induced hypertrophy of cardiac myocytes and involvement of akt and nfκb signal pathways. Journal of Cellular Biochemistry，2008，103:1718-1731.

[8]Liu X, Hou J, Shi L, et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against ischemia-induced apoptosis in vivo. Stem Cells Dev， 2009，18:947-954.

[9]Gao J, Zhang D, Yang X, et al. Lysophosphatidic acid and lovastatin might protect kidney in renal i/r injury by downregulating mcp-1 in rat. Renal Failure， 2011，33:805-810.

[10]Savitz SI, Dhallu MS, Malhotra S, et al. Edg receptors as a potential therapeutic target in retinal ischemia reperfusion injury. Brain Research, 2006,1118:168-175.

[11]Aoki J. Two pathways for lysophosphatidic acid production. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids，2008，1781:513-518.

The Protective Role With its Mechanism of Lysophosphatidic Acid on Hypoxia/Re-Oxygenation Induced Neonatal Rat’s H9c2 Cardiomyocyte Injury

YANG Jin-jing, CHEN Hai-bo, WANG Xian-yun, FAN Xue-song, CONG Xiang-feng, CHEN Xi.

State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

Corresponding Author: CHEN Xi, Email: chenxifw@126.com

Objectives: To investigate the protective role with its mechanism of lysophosphatidic acid (LPA) on hypoxia/reoxygenation (H/R) induced neonatal rat’s H9c2 cardiomyocyte injury.Methods: The H/R model of neonatal rat’s H9c2 cardiomyocyte was established and the experiment was divided into 4 groups. Control group, with normal H9c2 cell. H/R group, no FBS cultured H9c2 cell was incubated in hypoxia condition for 24 hours and then cultured in 10% FBS-DMEM with routine oxygen concentration for 3 hours. H/R+LPA group and H/R+OMPT (LPA3 receptor agonist) group, the cells were treated by either LPA at (1, 10, 25)μM or OMPT at(1, 5, 10)μM for 1 hour respectively, then the cells received H/R procedures. The cell viability was examined by trypan blue staining, cell caspase-3/7 activity was detected with the commercial kit, cell apoptosis was measured by flow cytometry, and apoptotic proteins were analyzed by western blot analysis.Results: Compared with Control group, H/R group had decreased cell viability and increased early stage cell apoptosis, P＜0.05 respectively. Compared with H/R group, H/R+LPA group showed increased cell viability, P＜0.05, and LPA 10μM was the best, in addition, LPA (1, 25)μM treated cells had decreased caspase-3/7 activity, P＜0.05. Comparedwith H/R group, H/R+OMPT group presented reduced Bax protein expression and elevated Bcl-2 protein expression, P＜0.05 or P＜0.01.Conclusion: LPA may protect H/R induced neonatal rat’s H9c2 cardiomyocyte injury by activating LPA3 receptor and suppressing the mitochondrial apoptotic pathway.

Lysophosphatidic acid; Hypoxia/Re-oxygenation; Cardiomyocytes

2013-01-14）

(編輯：常文靜 )

國家重點基礎研究發展計劃 (973 計劃 2010CB529500) 國家自然科學基金資助項目 (81170154)

100037 北京市，北京協和醫學院 中國醫學科學院 阜外心血管病醫院 心血管疾病國家重點實驗室

楊晉靜 博士研究生 主要研究方向為磷脂分子及其信號調控 Email：imyangjj@163.com 通訊作者：陳曦 Email：chenxifw@126.com

R54

A

1000-3614（2013）03-0222-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.03.018

方法：建立 H9c2 心肌細胞和原代乳鼠心肌細胞缺氧 /復氧模型。實驗分組 : 對照組：不做任何處理； 缺氧 /復氧組 (H/R 組 )：無血清培養的細胞在缺氧罐中缺氧 24 h 后，換含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養液在常氧條件下培養 3 h；LPA 預處理組 (H/R+LPA 組 )和 LPA3 受體特異激動劑（OMPT）預處理組 (H/R+OMPT 組 )：細胞分別用 LPA(1，10，25 μM) 和 OMPT(1，5，10 μM) 處理 1 h 后，進行缺氧 /復氧，復氧時不加 LPA 和 OMPT。臺盼藍染色和細胞活性試劑盒檢測細胞活力。流式細胞術檢測凋亡細胞，Caspase-3/7 活性檢測試劑盒分析 Caspase-3/7 活性，免疫印跡檢測凋亡相關蛋白包括裂解的 Caspase-3，Bcl-2 和 Bax 蛋白表達。

結果：與對照組相比，H/R 組的 H9c2 心肌細胞的活細胞數和細胞存活率均降低 (P 均 ＜0.05)；早期凋亡細胞數增加 (P＜0.05)。與 H/R 組相比，H/R+LPA 組的心肌細胞活細胞數和細胞存活率增加 (P 均 ＜0.05)，其中以 10 μM 濃度的 LPA 作用最為明顯。10 μM LPA 也提高了原代乳鼠心肌細胞存活率 (P＜0.05)。H/R+LPA 組兩個濃度 (LPA 1,10 μM) H9c2 心肌細胞的 Caspase-3/7 活性較 H/R 組顯著降低 (P＜0.05)。同時，H/R+OMPT 組三個濃度較 H/R 組都減少線粒體促凋亡 Bax 蛋白表達，增加了線粒體抗凋亡 Bcl-2 蛋白表達 (P＜0.05 或 0.01)。

結論：LPA 可能通過激活 LPA3 受體，抑制線粒體依賴的細胞凋亡途徑，保護缺氧 /復氧誘導的心肌細胞損傷 ,為心肌缺血再灌注損傷的防治提供了新的理論依據。