WNK1基因多態(tài)性與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑降壓療效的相關(guān)性研究

劉潔琳，劉 雅，王佐廣，王 皓，李 梅，王麗娟，溫紹君

原發(fā)性高血壓病(essential hypertension，EH)是一種遺傳因素與環(huán)境因素相互作用所致的多基因遺傳性疾病[1]。有效的降壓治療可使腦卒中和心肌梗死的風(fēng)險分別降低40%和15%[2]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotension converting enzyme inhibitor，ACEI)作為一線降壓藥物，可通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的作用，減少血管緊張素Ⅱ的生成，降低血壓水平，但不同EH患者對于ACEI的療效及不良反應(yīng)存在個體差異和種族差異，這種差異與個體間的遺傳異質(zhì)性有一定關(guān)系[3]。血管緊張素Ⅱ的生物學(xué)效應(yīng)除了收縮血管外，還包括調(diào)節(jié)腎小管的水鈉重吸收和刺激醛固酮的分泌等。近期研究表明，血管緊張素Ⅱ增加水鈉重吸收的作用部分是通過缺乏賴氨酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-應(yīng)激激活蛋白激酶(WNKs-SPAK)依賴的途徑來實現(xiàn)的[4]，因此我們推測除了腎素血管緊張素系統(tǒng)的基因外，缺乏賴氨酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(WNKs)基因可能也是影響ACEI降壓療效的候選基因之一。WNKs在人體內(nèi)有4個亞型，即WNK1、WNK2、WNK3和WNK4，WNKs可以調(diào)節(jié)所有陽離子-Cl-轉(zhuǎn)運載體，包括Na+-Cl-轉(zhuǎn)運載體、K+-Cl-轉(zhuǎn)運載體等。研究發(fā)現(xiàn)，WNK1基因內(nèi)含子1的大片斷缺失或在WNK4基因的高度保守區(qū)域發(fā)生錯義突變可引起單基因性高血壓——假性低醛固酮血癥Ⅱ型[5]，這是一種少見的常染色體顯性遺傳病，表現(xiàn)為容量依賴性高血壓，伴有高血鉀、高氯性代謝性酸中毒、而無任何腎小球異常。故此，WNK1和WNK4基因被認(rèn)為可能是EH的候選基因之一，目前有報道WNK1基因單核苷酸多態(tài)性rs880054(T/C)、rs2301880與EH發(fā)病相關(guān)[6]，但未見有關(guān)WNK1基因多態(tài)性與ACEI降壓敏感性的相關(guān)報道。本研究旨在探討在中國漢族EH患者中，WNK1基因多態(tài)性rs880054(T/C)、rs2301880與ACEI類藥物降壓療效的相關(guān)性。

1　對象與方法

1.1研究對象選取2010年6—11月于北京市昌平區(qū)城區(qū)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心就診的EH患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：漢族，無一、二級親屬關(guān)系；年齡18～79歲；未服用過任何抗高血壓藥物的新發(fā)EH患者；收縮壓(SBP)140～179 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，舒張壓(DBP)90～109 mm Hg；簽署知情同意書同意參加本研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：SBP≥180 mm Hg和(或)DBP≥110 mm Hg或因合并癥復(fù)雜需聯(lián)合用藥的患者；單純收縮期高血壓、繼發(fā)性高血壓患者和腎動脈狹窄者；合并糖尿病，近1年內(nèi)有心肌梗死、充血性心力衰竭(心衰)、腦卒中或不穩(wěn)定型心絞痛史者；肝腎功能不全者；患者不能遵守研究方案，如不能隨訪以及不能完成本研究。經(jīng)過篩查共入選140例EH患者，其中有19例患者因為不能耐受的干咳、頭痛等不良反應(yīng)和用藥期間新發(fā)冠心病和腦血管病而未完成隨訪，本研究最終完成了121例患者的隨訪，其中男49例，女72例；平均年齡為(51±10)歲。

1.2研究方法所有入選患者經(jīng)詢問病史、體檢并完成心電圖、超聲心動圖、血尿常規(guī)和生化檢查后，予以ACEI類藥物貝那普利(北京諾華制藥有限公司，生產(chǎn)批號：H20000292)進(jìn)行降壓治療。起始劑量為10 mg/d，每2周隨訪一次，測量血壓并記錄患者的用藥感覺、不良反應(yīng)(如咳嗽、頭暈、皮疹及水腫等)；第4周末，如血壓≥140/90 mm Hg，則劑量加倍。8周隨訪期結(jié)束后，按照衛(wèi)生部制定的心血管藥物臨床研究指導(dǎo)原則對降壓療效進(jìn)行評定，顯效：DBP下降≥10 mm Hg并降至正常，或下降≥20 mm Hg；有效：DBP下降<10 mm Hg并降至正常，或下降10～19 mm Hg，或SBP下降≥30 mm Hg；無效：未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.3基因多態(tài)性檢測方法采用EDTA抗凝的采血管收集入選患者的外周靜脈血3～5 ml，保存于-20 ℃的冰箱中。采用改良的酚-氯仿法抽提基因組DNA。采用TaqMan MGB等位基因分型試劑盒(含相應(yīng)的探針和引物，購自美國ABI公司)，根據(jù)說明書操作，在9700型高通量熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后經(jīng)ABI HT 7900型熒光掃描儀掃描。采用SDS 2.0圖像分析軟件Allelic Discrimination程序進(jìn)行終點分析，通過檢測不同等位基因所標(biāo)的FAM和VIC熒光強(qiáng)度，判斷各待測樣本基因分型為野生純合子、突變純合子還是雜合子。

2　結(jié)果

2.1基因型分布情況在121例患者中，本研究成功檢測到119例患者的rs880054位點和120例患者的rs2301880位點。各基因型患者的一般資料比較中，除rs2301880位點不同基因型的心率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)外，其余差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1)。WNK1基因多態(tài)性rs880054、rs2301880的基因型分布見表2，對研究對象各位點的基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗，結(jié)果顯示均符合Hardy-Weinberg平衡(rs880054：P=0.82；rs2301880：P=0.28)。

2.2WNK1基因多態(tài)性與ACEI降壓療效的相關(guān)性rs880054位點和rs2301880位點不同基因型的降壓療效間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

rs880054位點不同基因型的DBP降低幅度間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，CC基因型與TT、TC基因型間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為4.427、3.189，P<0.05)，TT與TC基因型間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q=1.682，P>0.05)；不同基因型的SBP降低幅度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。rs2301880位點不同基因型的DBP降低幅度間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，CC基因型與CT、TT基因型間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為2.591、2.453，P<0.05)，TT與CT基因型間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q=1.134，P>0.05)；不同基因型的SBP降低幅度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

經(jīng)多元逐步回歸分析，對可能影響ACEI類藥物降壓療效的因素進(jìn)行校正，包括：年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙、飲酒、心率、ACEI藥物劑量、血脂、血糖和肝腎功能等生化指標(biāo)，分別分析rs880054和rs2301880不同基因型與DBP、SBP降低幅度的相關(guān)性。結(jié)果顯示：rs880054位點不同基因型與治療后DBP的降低幅度有關(guān)(R2=0.167，P<0.001)；rs2301880位點不同基因型同樣與經(jīng)ACEI治療后DBP的降低幅度有關(guān)(R2=0.080，P=0.003)；未發(fā)現(xiàn)上述兩位點與SBP降低幅度的相關(guān)性。

表1　不同基因型患者的一般資料比較

注：BMI=體質(zhì)指數(shù)，SBP=收縮壓，DBP=舒張壓，ALT=谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，BUN=尿素氮，Cr=肌酐，TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，GLU=血糖；*為χ2值，余檢驗統(tǒng)計量值為F值

表2不同基因型患者的降壓療效比較

Table2Comparison of antihypertensive effects among patients with different genotype

例數(shù)降壓療效 無效 有效 顯效χ2值P值rs88005417.0570.002 TT555941 TC5161431 CC13562rs230188011.3680.023 CC6561148 CT4771525 TT8332

Table3Comparison of reduction of blood pressure among patients with different genotype

例數(shù)SBP降低幅度DBP降低幅度rs880054 TT5520.0±11.913.4±5.7 TC5117.9±9.711.4±6.2 CC1312.2±10.9 4.8±2.1 F值2.6039.618 P值0.0790.000rs2301880 CC6519.7±12.013.3±5.8 CT4717.4±9.310.0±7.0 TT 8 13.0±10.6 7.6±2.3 F值1.4824.879 P值0.2310.009

3　討論

目前EH的治療仍然是以藥物降壓為主。長期以來，高血壓患者降壓藥物的選擇主要根據(jù)臨床經(jīng)驗和相關(guān)指南，然而不同個體對高血壓藥物治療的反應(yīng)有很大差異。盡管很多環(huán)境因素和非遺傳因素如年齡、性別和基礎(chǔ)血壓水平等都可以影響降壓治療的效果，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)抗高血壓藥物療效的個體差異與個體的基因變異密切相關(guān)，相關(guān)通路上的基因變異可以解釋20%～95%的藥物反應(yīng)個體差異[8-9]。因此有關(guān)高血壓相關(guān)基因多態(tài)性與降壓藥物的療效和不良反應(yīng)的研究已成為眾多研究者所關(guān)注的熱點。應(yīng)用基因多態(tài)性探討高血壓個體化治療方案的基礎(chǔ)與臨床研究具有重要意義。

WNK1基因位于12號染色體上，全長160 kb，含有28個外顯子。Tobin等[6]曾報道在歐洲白人中，位于WNK1基因第10內(nèi)含子的rs880054位點和第23內(nèi)含子的rs2301880位點與24 h平均SBP和DBP水平顯著相關(guān)，rs2301880位點的最小等位基因頻率為26%，TT型與CC型相比，24 h平均SBP水平低3.5 mm Hg以上。另外，最新研究顯示，該基因除了參與調(diào)節(jié)水鈉重吸收外，還可通過α1-腎上腺素能受體-Gαq/11蛋白通路收縮動脈血管[10]，進(jìn)而參與高血壓等心血管疾病的病理生理過程。由于Gαq/11蛋白通路也是血管緊張素Ⅱ?qū)е卵苁湛s的信號通路之一，因此本研究探討了WNK1基因上兩個單核苷酸多態(tài)性rs880054和rs2301880與ACEI類藥物降壓療效的相關(guān)性，結(jié)果顯示上述兩位點均與ACEI治療后DBP的降低幅度有關(guān)，rs880054位點TT基因型患者和rs2301880位點CC基因型患者可能對ACEI類藥物更敏感。

WNK1基因雖然不是ACEI類藥物的靶基因，但有體外研究顯示，血管緊張素Ⅱ可減輕WNK4對腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合管上Na+-Cl-共轉(zhuǎn)子(NCC)的抑制作用，使得NCC活性增加，導(dǎo)致水鈉潴留[11]。雖然目前尚無研究顯示血管緊張素Ⅱ也是WNK1的上游調(diào)節(jié)因子，但由于WNK1也是通過抑制WNK4的作用導(dǎo)致鈉氯重吸收增加的[12]，與血管緊張素Ⅱ的作用通路相同，此外ACEI除了抑制血管緊張素I向血管緊張素Ⅱ的轉(zhuǎn)化外，還會減少血管緊張素Ⅱ的促醛固酮分泌作用，而醛固酮也是通過WNKs參與NCC磷酸化的級聯(lián)反應(yīng)[4]，導(dǎo)致水鈉潴留的，因此我們推測WNK1基因的改變可能會與高血壓患者對ACEI類藥物降壓反應(yīng)的個體差異有關(guān)，本研究結(jié)果在一定程度上證實了此推測。

目前，有關(guān)rs880054和rs2301880位點增加高血壓發(fā)病風(fēng)險和影響ACEI類藥物降壓敏感性的機(jī)制還不清楚。雖然上述兩個單核苷酸多態(tài)性均位于內(nèi)含子，其變異不會導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變，但有研究證實位于基因內(nèi)部的單核苷酸多態(tài)性可以通過影響基因的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯或者翻譯后蛋白質(zhì)產(chǎn)物的活性等影響基因的功能。還有一種可能是這兩個單核苷酸多態(tài)性與具有啟動子功能的單核苷酸多態(tài)性存在完全連鎖不平衡從而改變WNK1蛋白的表達(dá)，但這均需要進(jìn)一步的功能研究來證實。

1Liu K,Liu Y,Liu J,et al.α-adducin Gly460Trp polymorphism and essential hypertension risk in Chinese:A meta-analysis[J].Hypertens Res,2011,34(3):389-399.

2MacMahon S,Rodgers A,Neal B,et al.Blood pressure lowering for the secondary prevention of myocardial infarction and stroke[J].Hypertension,1997,29(2):537-538.

3王佐廣，彭曉云，李麗立，等.中國人ACE I/D基因多態(tài)性與高血壓患者ACEI降壓效果的meta分析[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(23)：3566-3570.

4Talati G,Ohta A,Rai T,et al.Effect of angiotensin II on the WNK-OSR1/SPAK-NCC phosphorylation cascade in cultured mpkDCT cells and in vivo mouse kidney[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,393(4):844-848.

5Wilson FH,Disse-Nicodeme S,Choate KA,et al.Human hypertension caused by mutations in WNK kinases[J].Science,2001,293(5532):1107-1112.

6Tobin MD,Raleigh SM,Newhouse S,et al.Association of WNK1 gene polymorphisms and haplotypes with ambulatory blood pressure in the general population[J].Circulation,2005,112(22):3423-3429.

7林金秀，吳可貴.1999年世界衛(wèi)生組織/國際高血壓聯(lián)盟關(guān)于高血壓治療指南[J].高血壓雜志，1999，7(2)：97-100.

8Marteau JB,Zaiou M,Sierst G,et al.Genetic determinants of blood pressure regulation[J].J Hypertens,2005,23(12):2127-2143.

9Sciarrone MT.ACE and ɑ-adducin polymorphism as markers of individual response to diuretic therapy[J].Hypertension,2003,41(3):398-403.

10Bergaya S,Faure S,Baudrie V,et al.WNK1 regulates vasoconstriction and blood pressure response to α 1-adrenergic stimulation in mice[J].Hypertension,2011,58(3):439-445.

11San-Cristobal P,Pacheco-Alvarez D,Richardson C,et al.Angiotensin II signaling increases activity of the renal Na-Cl cotransporter through a WNK4-SPAK-dependent pathway[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(11):4384-4389.

12Wilson FH,Kahle KT,Sabath E,et al.Molecular pathogenesis of inherited hypertension with hyperkalemia:The Na-Cl cotransporter is inhibited by wild-type but not mutant WNK4[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003，100(2):680-684.