白介素12基因多態性與惡性腫瘤易患性的病例對照研究Meta分析

張 雄，金粉淑，張立國，陳瑞雪，趙金慧，王雁楠，王恩富，姜振東

惡性腫瘤已成為導致人類死亡的最主要原因之一。由于人口的老齡化、環境污染加劇及吸煙、缺乏鍛煉、高脂高熱量飲食等不良生活方式對健康的嚴重危害，全球范圍內每年惡性腫瘤發生率和死亡率不斷上升[1]。惡性腫瘤是由于原癌基因的激活和抑癌基因的失活所導致的多基因遺傳易患性疾病。通過研究這些具有腫瘤特異性的基因突變，可以揭示惡性腫瘤發生和發展過程中細胞潛在的活動方式，并能進一步應用于惡性腫瘤的早期診斷和治療[2]。

白介素12(interleukin-12，IL-12)作為一種炎性細胞因子，是連接早期非特異免疫反應和繼發抗原特異性免疫反應的橋梁，主要由抗原激活的單核/巨噬細胞、樹突細胞等抗原遞呈細胞產生[3]。近年來，國內外多項研究均報道了IL-12基因在惡性腫瘤發生和發展過程中的重要作用，但對于IL-12基因多態性與惡性腫瘤易患性的具體關聯如何各研究結果尚存在爭議。因此，本研究運用偱證醫學Meta分析方法，全面收集相關病例對照研究，探討IL-12基因多態性與惡性腫瘤易患性的具體關聯，以期為臨床早期診斷和治療惡性腫瘤提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準 文獻納入標準：(1)研究類型：有關IL-12基因多態性與惡性腫瘤易患性關聯的病例對照研究；(2)病例組患者均經臨床和病理診斷為不同部位的惡性腫瘤；(3)納入文獻均提供完整的病例資料、等位基因或基因型頻率等數據；(4)納入文獻對照組基因型頻率均符合遺傳學哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)；(5)納入文獻的語言均為中文或英文。文獻排除標準：(1)病例報告、文摘、綜述、講座、述評等非病例對照研究；(2)與研究主題或目的無關；(3)研究中對照組基因型頻率不符合遺傳學HWE或家族性研究；(4)數據資料有誤或無法提??；(5)重復發表的文獻。

1.2 檢索策略 計算機檢索PubMed、Embase、Web of Science、CBM、萬方、維普、中國知網(CNKI)等數據庫，時間為1998年1月—2013年1月，并手工檢索所有納入文獻的參考文獻以獲取補充資料。全面收集有關IL-12基因多態性與惡性腫瘤易患性關聯的病例對照研究。文獻檢索策略采用主題詞和自由詞結合的原則，英文檢索詞主要包括：interleukin-12、IL-12、IL-12A、IL-12B、cancer、tumor、carcinoma、neoplasms、SNPs、mutation、variant、polymorphism等；中文檢索詞主要包括：白介素12、癌癥、癌、腫瘤、惡性腫瘤、多態性、突變等。

1.3 數據提取 采用統一制定的數據收集表，由兩位研究者分別獨立提取納入文獻數據資料，主要數據信息包括：第一作者、發表時間、國家、語言、種族、研究設計、病例組和對照組例數、對照組人群來源、腫瘤類型、基因檢測方法、等位基因或基因型頻率、對照組HWE情況等。若納入文獻涉及亞洲人、歐洲人、非洲人等多個種族，則根據人種不同分別提取數據；如存在爭議，通過與第三方討論解決分歧。

1.4 納入文獻質量評價 由兩位研究者根據Newcastle-Ottawa Scale(NOS)評分量表分別對納入文獻的質量進行評價[4]。NOS評分量表滿分為 9 分，包括病例組和對照組研究對象的定義和選擇、兩組的可比性、暴露因素的確定三方面內容。

1.5 統計學方法 采用STATA 12.0軟件進行Meta分析。IL-12A和IL-12B基因多態性與惡性腫瘤易患性的具體關聯采用相對危險度(relative risk，RR)及其95%可信區間(95% confidence interval，95%CI)進行描述。匯總RR值的統計學意義采用Z檢驗[5]。對照組人群基因型的HWE采用χ2檢驗評價。各研究間異質性采用CochranQ檢驗進行評價，P<0.05提示存在異質性；此外，采用I2檢驗定量評價異質性大小，I2值在0～100%，I2值愈大提示異質性愈明顯；如異質性檢驗P<0.05或I2>50%，提示各研究間存在異質性，采用隨機效應模型(DerSimonian Laird法)進行Meta分析，反之則采用固定效應模型(Mantel-Haenszel法)進行Meta分析。根據腫瘤類型或種族來源不同進行亞組分析，以探討異質性的可能來源，并逐一刪除納入研究進行敏感性分析，以評價單一研究對總體結果的影響。采用Begger漏斗圖和Egger線性回歸分析納入文獻是否存在發表偏倚，以評價原始分析結果的真實可靠性[6]。

2 結果

2.1 納入文獻的基本特征和質量評價 最初檢索到相關文獻78篇，依據納入和排除標準進行文獻篩選，根據題目和摘要剔除48篇與研究主題無關的文獻，進一步仔細閱讀摘要及全文后剔除12篇文獻，最終納入18篇文獻[7-24](見圖1)。

18項病例對照研究共包括6 463例惡性腫瘤患者和7 412例健康對照者，發表時間在2003—2012年。病例組患者均經臨床和病理檢查確診。共涉及4個單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)，包括IL-12A基因的3′UTR G>A(rs568408)、IVS2 T>A(rs582054)和5′UTR T>G(rs2243115)多態性以及IL-12B基因的3′UTR A>C(rs3212227)多態性。納入的18項研究中，10項研究對象為亞洲人群，7項為歐美人群，僅1項為非洲人群。所有納入研究的對照組基因型頻率均符合遺傳學HWE。18項納入研究中，僅2項研究質量評分低于5分，提示本Meta分析大部分納入研究質量較高。納入文獻的基線特征及質量評分見表1。

2.2 Meta分析結果

2.2.1 IL-12A基因多態性與惡性腫瘤易患性的關聯 納入文獻中，5項研究[9，11-12，15，21]探討了IL-12A基因3′UTR G>A多態性與惡性腫瘤易患性的關聯，其中3項為亞洲人群，僅2項為歐美人群。異質性檢驗顯示各研究間存在異質性(I2>50%，P<0.05)，故采用隨機效應模型。Meta分析結果顯示，IL-12A基因3′UTR G>A多態性與惡性腫瘤易患性無關聯〔A vs.G：RR=1.03，95%CI(0.80，1.34)，P=0.802；GA+AA vs.GG：RR=1.04，95%CI(0.82，1.32)，P=0.728〕；進一步的種族亞組分析結果亦表明，IL-12A基因3′UTR G>A多態性與亞洲人群〔A vs.G：RR=1.10，95%CI(0.77，1.56)，P=0.596；GA+AA vs.GG：RR=1.09，95%CI(0.78，1.53)，P=0.606〕和歐美人群〔A vs.G：RR=0.94，95%CI(0.76，1.15)，P=0.519；GA+AA vs.GG：RR=0.95，95%CI(0.82，1.11)，P=0.505〕惡性腫瘤易患性均無關聯(見圖2)。

3項亞洲人群研究[15，21，24]探討了IL-12A基因5′UTR T>G多態性與惡性腫瘤易患性的關聯。異質性檢驗顯示各研究間存在異質性(I2>50%，P<0.05)，故采用隨機效應模型。

表1 Meta分析納入研究的基線特征

注：ARMS-PCR=擴增阻滯突變系統聚合酶鏈技術，DHPLC=變性高效液相色譜，TaqMan=序列特異熒光標記探針，MassArray=分子量陣列分析，DNA sequencing=直接測序法，PCR-RFLP=聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分析

圖1 文獻篩選流程圖

Meta分析結果顯示，IL-12A基因5′UTR T>G多態性也與惡性腫瘤易患性無關聯〔G vs.T：RR=1.09，95%CI(0.74，1.60)，P=0.670；TG+GG vs.TT：RR=1.03，95%CI(0.77，1.38)，P=0.825〕。

僅有2項亞洲人群研究[11-12]探討了IL-12A基因IVS2 T>A多態性與惡性腫瘤易患性的關聯。2項研究間無異質性(I2>50%，P>0.05)，故采用固定效應模型。Meta分析結果顯示，IL-12A基因IVS2 T>A多態性與惡性腫瘤易患性亦無關聯〔A vs.T：RR=1.12，95%CI(1.00，1.26)，P=0.052；TA+AA vs.TT：RR=1.08，95%CI(0.98，1.19)，P=0.135〕。

2.2.2 IL-12B基因多態性與惡性腫瘤易患性的關聯 納入文獻中，13項研究[7，9，12，14-21，23-24]探討了IL-12B基因3′UTR A>C多態性與惡性腫瘤易患性的關聯，包括9項亞洲人群研究、3項歐美人群研究和1項非洲人群研究。異質性檢驗顯示各研究間存在異質性(I2>50%，P<0.05)，采用隨機效應模型。Meta分析結果顯示，IL-12B基因的3′UTR A>C多態性與惡性腫瘤易患性增加有關聯〔C vs.A：RR=1.06，95%CI(1.03，1.10)，P<0.001；CA+CC vs.AA：RR=1.05，95%CI(1.02，1.08)，P=0.001〕，提示3′UTR A>C多態性可能增加惡性腫瘤發生風險(見圖3)。

進一步的種族亞組分析結果顯示，IL-12B基因3′UTR A>C多態性可能增加亞洲人群惡性腫瘤易患性〔C vs.A：RR=1.04，95%CI(1.01，1.08)，P=0.017；CA+CC vs.AA：RR=1.04，95%CI(1.01，1.07)，P=0.018〕，但與歐美人群惡性腫瘤易患性無關聯〔C vs.A：RR=1.06，95%CI(0.96，1.17)，P=0.279；CA+CC vs.AA：RR=1.05，95%CI(0.96，1.15)，P=0.311〕。盡管IL-12B基因3′UTR A>C多態性可能增加非洲人群惡性腫瘤易患性(見圖3)，但單個研究[20]的結果缺乏可信度。此外，根據腫瘤類型不同進行亞組分析，結果顯示IL-12B基因3′UTR A>C多態性與宮頸癌〔C vs.A：RR=1.11，95%CI(1.01，1.22)，P=0.032；CA+CC vs.AA：RR=1.10，95%CI(1.01，1.19)，P=0.023〕、鼻咽癌〔C vs.A：RR=1.28，95%CI(1.16，1.40)，P<0.001；CA+CC vs.AA：RR=1.24，95%CI(1.15，1.35)，P<0.001〕易患性增加關系密切；而與大腸癌、腦腫瘤及其他惡性腫瘤的易患性無關聯(均P>0.05)。

圖2 IL-12A基因3′UTR G>A多態性與不同種族人群惡性腫瘤易患性的關聯

Figure2 Forest plot of the association between IL-12A 3′UTR G>A polymorphism and cancer risk among different populations

2.3 敏感性分析和發表偏倚評價 本研究逐一刪除納入研究進行敏感性分析，以評價單一研究對IL-12B基因3′UTR A>C多態性與惡性腫瘤易患性的關聯，結果表明無單一研究可顯著影響原始分析和亞組分析結果的統計學意義(見圖4)。針對IL-12B基因3′UTR A>C多態性原始分析結果進行發表偏倚評價，Begger漏斗圖提示圖形對稱無明確發表偏倚(見圖5)，Egger線性回歸分析進一步證實納入文獻無發表偏倚(C vs.A：t=0.67，P=0.52；CA+CC vs.AA：t=0.80，P=0.44)。

3 討論

目前，新的遺傳學和分子生物學腫瘤標志物已逐漸成為惡性腫瘤早期預防和診治的重要監測指標。多項遺傳學研究表明，細胞因子基因突變與惡性腫瘤、先天畸形等多種疾病之間有著密切的聯系，它可通過改變基因表達水平，干擾信號傳導通路，抑制蛋白合成并且造成外顯子mRNA的不穩定性，從而導致惡性腫瘤的發生[25]。IL-12基因突變可能會改變蛋白的表達水平或功能，從而導致免疫系統失調、自身免疫性疾病，并最終可能導致惡性腫瘤發生[9]。近年來，IL-12基因多態性被認為是促成多種惡性腫瘤發生的危險因素，如宮頸癌、鼻咽癌、肝癌、大腸癌、胃癌、乳腺癌、頭頸部惡性腫瘤等，但其與惡性腫瘤易患性關聯的相關研究結果尚存爭議，故有必要采用循證醫學Meta分析的方法明確二者之間的具體關聯。

圖3 IL-12B基因3′UTR A>C多態性與不同種族人群惡性腫瘤易患性的關聯

Figure3 Forest plot of the association between IL-12B 3′UTR A>C polymorphism and cancer risk among different populations

本文Meta分析共納入了18項病例對照研究，涉及6 463例惡性腫瘤患者和7 412例健康對照者，包括IL-12A和IL-12B基因的4種常見SNP。Meta分析結果證實，IL-12B基因3′UTR A>C(rs3212227)多態性可顯著提高多種惡性腫瘤的易患性，但IL-12A基因3種多態性3′UTR G>A(rs568408)、IVS2 T>A(rs582054)和5′UTR T>G(rs2243115)對個體惡性腫瘤易患性無明確影響。由于種族、遺傳及環境因素差異可能會通過基因-環境相互作用的方式改變惡性腫瘤的發病風險，故本研究根據種族不同進行了亞組分析，結果表明IL-12B基因3′UTR A>C多態性可能會增加亞洲人群惡性腫瘤的易患性，但與歐美人群惡性腫瘤易患性無明確關聯。進一步根據腫瘤類型進行亞組分析，結果表明IL-12B基因3′UTR A>C多態性與宮頸癌、鼻咽癌發病風險增加有關聯，而與其他惡性腫瘤無關聯，提示IL-12B基因在亞洲人群宮頸癌、鼻咽癌的發生發展過程中發揮著更為重要的作用。研究發現，IL-12B基因3′UTR A>C多態性2個等位基因在不同人群中的分布頻率基本一致，A∶C約為3∶1，基因突變時堿基C替換堿基A后產生一個TaqI限制性內切酶的酶切位點，影響IL-12B mRNA表達，從而導致IL-12表達異常。

圖4 IL-12B基因3′UTR A>C多態性與惡性腫瘤易患性關聯的敏感性分析

Figure4 Sensitivity analysis for the association between IL-12B 3′UTR A>C polymorphism and cancer risk

雖然本研究經過科學合理地設計和實施，但仍存在著以下局限性：首先，盡管Begger漏斗圖和 Egger線性回歸分析均未顯示存在發表偏倚，但選擇性語言偏倚仍可能存在，因為本研究僅納入了中英文發表的研究；其次，由于納入文獻樣本量的局限，對于某些特殊類型的惡性腫瘤無法進行亞組分析以明確其與IL-12基因的關聯，導致本研究的臨床應用價值受到局限；第三，本文Meta 分析是基于納入文獻原始數據進行的分析，無法校正原始研究中存在的統計學不足和數據不合理以及可能存在的潛在混雜因素，如種族、年齡、性別、地域分布等。另外，雖然所有納入研究對病例組和對照組制定了一定的入組標準，但各研究間仍然存在入組標準的差異和一些混雜因素控制不足等問題，故而影響本研究結果的真實性和可靠性。

圖5 Begger漏斗圖評價發表偏倚

總之，通過對18項納入研究的綜合分析，得到以下初步結論：IL-12B基因的3′UTR A>C(rs3212227)多態性可能是亞洲人群惡性腫瘤易患性增加的危險因素，尤其是宮頸癌和鼻咽癌。由于納入文獻數量、質量及樣本量的局限，本研究結論尚需大樣本、高質量、設計合理的臨床研究或流行病學研究加以證實。

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