吉西他濱對人骨肉瘤細胞增殖及腫瘤轉移相關基因1 mRNA表達的影響

胡旭昌，王栓科，康學文，張海鴻，汪 靜，萬 麟，安麗萍，劉文忠，馬靖琳，王翠芳

骨肉瘤是最常見的人類惡性腫瘤，盡管應用化療、放療、手術治療骨肉瘤在過去幾十年取得了很大的進步，但并未顯著提高本病的治愈率，尤其是多學科綜合治療后肺轉移的問題，15%～25%的患者需重新化療和切除轉移灶[1-2]。吉西他濱具有廣譜抗腫瘤活性[3]，對多種腫瘤細胞在體外表現出明顯的細胞毒作用[4-5]。本研究通過觀察吉西他濱對人骨肉瘤MG-63細胞株在體外的抗腫瘤作用，探討其在抑制腫瘤細胞增殖及抑制人骨肉瘤細胞系腫瘤轉移相關基因1(MTA1)mRNA表達的作用，為有效治療骨肉瘤提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞來源人骨肉瘤細胞株MG-63購于中國科學院細胞庫。

1.1.2主要試劑吉西他濱(哈爾濱譽衡藥業股份有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM/F12(武漢博士德生物工程有限公司)，青霉素、鏈霉素(哈爾濱制藥集團有限公司)，二甲亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)，RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)，反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒、實時定量試劑盒(Takara公司)。

PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。人β-actin引物序列：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；人MTA1序列：上游引物5′-CGGCATCCATGCTGCTCTTA-3′，下游引物5′-ACTGGTCGATCTGCTTGTCTGTG-3′。

1.1.3主要儀器二氧化碳(CO2)細胞培養箱、臺式低溫高速離心機(Heraeus公司)，超純水儀(USFELGA公司)，臺式高速離心機(上海醫用分析儀器廠)，超凈工作臺(江蘇蘇凈集團有限公司)，磁力攪拌器(WerkeGmbHCOKG公司)，酶標儀(Hyperion公司)，熒光顯微鏡(Olympus公司)，85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)，熒光定量PCR儀(Bioneer公司)。

1.2方法

1.2.1MG-63細胞的培養將人骨肉瘤MG-63細胞置于5%CO2、37 ℃培養箱中，常規培養于10%特級胎牛血清、雙抗(青霉素100 U/ml和鏈霉素100 U/ml)的DMEM/F12培養基中培養。當培養皿中細胞鋪至70%～80%時，在超凈臺內進行傳代。

1.2.2MTT法檢測吉西他濱對人骨肉瘤MG-63細胞增殖的影響將對數生長期的細胞接種于96孔板培養12 h后，細胞完全貼壁。然后加入含有不同濃度的吉西他濱(0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/L)培養基和DMSO，置于培養箱中繼續培養。作用24 h后停止干預，加入MTT，置于培養箱中培養4 h后中止，充分溶解結晶。用全自動酶標儀在570 nm檢測各孔吸光度(A)值，實驗重復5次，取平均值作為實驗組A值。抑制率=1-實驗組A值/空白對照組A值×100%，計算出標準差。

1.2.3RT-PCR測定MTA1 mRNA的表達選取對數生長期的人骨肉瘤MG-63細胞約0.5×106個，培養12 h后給予不同濃度的吉西他濱(0.100、0.200、0.400 mg/L)作用后，每個劑量組設3個復孔，設空白對照組。培養24 h后提取細胞RNA，反轉錄合成cDNA、PCR擴增目的基因。利用實時定量熒光PCR儀得到Ct值，通過以下換算方法得到實驗組mRNA相對表達量：2-△△Ct，△△Ct=△CtT-△CtP=(CtT-CtTE)-(CtP-CtPE)，CtT、CtTE、CtP、CtPE分別為實驗組Ct值、實驗組平均Ct值、內參(β-actin)Ct值、內參平均Ct值。

2　結果

2.1吉西他濱對人骨肉瘤MG-63細胞增殖的影響不同濃度吉西他濱(0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/L)作用24 h后，人骨肉瘤MG-63細胞抑制率間差異有統計學意義(P<0.05)；其中0.025、0.050 mg/L組抑制率均低于其他3組，0.100、0.200 mg/L組亦低于0.400 mg/L組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2吉西他濱對MTA1 mRNA表達的影響吉西他濱作用于人骨肉瘤MG-63細胞24 h后，經實時定量PCR檢測，0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他濱組MTA1 mRNA相對表達量分別為(0.86±0.16)、(0.68±0.12)、(0.46±0.08)，空白對照組MTA1 mRNA相對表達量為(1.01±0.15)，4組間差異有統計學意義(F=38.722，P=0.0093)；其中0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他濱組MTA1 mRNA相對表達量均低于空白對照組，且3個劑量吉西他濱組MTA1 mRNA相對表達量依次降低，差異均有統計學意義(P<0.01，見圖1)。

Table1Inhibition ratios of MG-63 cells treated with varying concentrations of gemcitabineon(after 24 h)

吉西他濱濃度(mg/L)MG-63細胞抑制率0 025　3 3±1 2　　　　　0 050　3 7±1 0　　　　　0 100　6 1±0 1?△　　　0 200　8 0±1 9?△　　　0 40011 5±1 4?△▲☆F值30 568P值0 0169

注：與0.025 mg/L組比較，*P<0.05；與0.050 mg/L組比較，△P<0.05；與0.100 mg/L組比較，▲P<0.05；與0.200 mg/L組比較，☆P<0.05

注：1、2、3、4分別為空白對照組及0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他濱組；MTA1=腫瘤轉移相關基因1

圖1不同濃度吉西他濱作用MG-63細胞后MTA1 mRNA的相對表達量

Figure1Effects of gemcitabineon on the mRNA expression of MTA1 in MG-63 cells

3　討論

臨床研究發現，吉西他濱能抑制骨肉瘤細胞生長，使細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡，并且可以與多西紫杉醇、卡鉑等多種化療藥聯合使用產生協同效應，增加抗腫瘤作用[6-7]；此外，其還可以增加放射治療的效果[8]。細胞凋亡是細胞毒性藥物治療的一種主要方式，本研究結果顯示吉西他濱對人骨肉瘤MG-63細胞的生長有抑制作用，并且呈劑量依賴性——0.025、0.050 mg/L吉西他濱作用24 h后，人骨肉瘤MG-63細胞抑制率均低于0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他濱，且0.100、0.200 mg/L吉西他濱作用24 h后，人骨肉瘤MG-63細胞抑制率亦低于0.400 mg/L吉西他濱。有報道稱吉西他濱對腫瘤細胞的增殖阻滯可能與p53、p21的表達有關[9]，也有研究認為吉西他濱誘導骨肉瘤細胞凋亡可能是通過Fas/FasL的死亡受體途徑[10]。

骨肉瘤發生轉移早，給臨床治療帶來了很大困難，其最常見的轉移部位是肺，這可能與腫瘤轉移相關的基因表達有關。MTA1是一種腫瘤轉移相關基因，其表達的增高與腫瘤轉移有直接的相關性，在多種轉移癌組織中都可檢測出MTA1的高表達，如乳腺癌、胃癌、大腸癌等[11]。有研究表明，MTA1可以明顯增加MG-63細胞株的侵襲能力[12]。本研究采用實時定量PCR檢測人骨肉瘤MG-63細胞MTA1 mRNA的相對表達量，發現0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他濱干預24 h后，人骨肉瘤MG-63細胞MTA1 mRNA相對表達量降低，從而證明吉西他濱可能通過降低MTA1 mRNA的表達來抑制骨肉瘤細胞的轉移。故MTA1在抑制骨肉瘤轉移基因治療機制中的作用值得進一步研究[13]。

綜上所述，吉西他濱能抑制人骨肉瘤MG-63細胞增殖，且有劑量依賴性；其作用機制可能是通過抑制MTA1 mRNA的表達，從而抑制MG-63細胞轉移。這為骨肉瘤的治療提供了新的可能。

1Rodriguez CO Jr，Crabbs TA，Wilson DW，et al.Aerosol gemcitabine：preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs[J].Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery，2010，23(4)：197-206.

2Jaffe N.Osteosarcoma：review of the past，impact on the future.The American experience[J].Cancer Treat Res，2009(152)：239-262.

3Fox E，Patel S，Wathen JK，et al.Phase Ⅱ study of sequential gemcitabine followed by docetaxel for recurrent Ewing sarcoma，osteosarcoma，or unresectable or locally recurrent chondrosarcoma：results of Sarcoma Alliance for Research Through Collaboration Study 003[J].Oncologist，2012，17(3)：321.

4Ando T，Ichikawa J，Okamoto A，et al.Gemcitabine inhibits viability，growth，and metastasis of osteosarcoma cell lines[J].J Orthop Res，2005，23(4)：964-969.

5Huang P，Plunkett W.Fludarabine-and gemcitabine-induced apoptosis：incorporation of analogs into DNA is a critical event[J].Cancer Chemother Pharmacol，1995，36(3)：181-188.

6McMahon MB.Gemcitabine in combination with carboplatin exhibits biologic activity against canine osteosarcoma[D].Ohio State University，2009.

7Navid F，Willert JR，McCarville MB，et al.Combination of gemcitabine and docetaxel in the treatment of children and young adults with refractory bone sarcoma[J].Cancer，2008，113(2)：419-425.

8Anderson PM，Wiseman GA.Gemcitabine radiosensitization after153Sm-EDTMP(quadramet) bone-seeking radioisotope therapy for osteoblastic lesions of osteosarcoma：activity and principles[J].Journal of Clinical Oncology，2005，23(1 Suppl)：8534.

9Tolis C，Peters GJ，Ferreira CG，et al.Cell cycle disturbances and apoptosis induced by topotecan and gemcitabine on human lung cancer cell lines[J].Eur J of Cancer，1999，35(5)：796-807.

10Koshkina NV，Kleinerman ES.Aerosol gemcitabine inhibits the growth of primary osteosarcoma and osteosarcoma lung metastases[J].International Journal of Cancer，2005，116(3)：458-463.

11Li X，Chen A，Yi C，et al.Correlation between expression of the MTA1 gene and the invasion and metastasis in human osteosarcoma cells[J].China Oncology，2006，23(4)：546-548.

12Chengla YI，Xinzhi L，Weiguo X，et al.Relationship between the expression of MTA-1 gene and the metastasis and invasion in human osteosarcoma[J].J Huazhong Univ Sci Technology Med Sci，2005，25(4)：445-447.

13Lee MH，Na H，Kim EJ，et al.Poly(ADP-ribosyl) ation of p53 induces gene-specific transcriptional repression of MTA1[J].Oncogene，2012，31(49)：5099-5107.