當歸—川芎藥對不同制法與配比抗氧化活性相互作用研究

黃美艷，唐于平，尚爾鑫，郭建明，劉欣，王林艷，李偉霞，段金廒

[摘要] 目的：應用響應曲面分析法觀察歸芎藥對不同制法、不同配比對DPPH自由基清除率體外抗氧化活性的相互作用研究。方法：采用2，2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）自由基清除率法測定當歸-川芎10個配比，3種不同提取方法的提取物的抗氧化活性，應用非線性回歸的方法確定量效曲線的各個參數，建立三維響應面模型，應用Matlab軟件構建響應曲面的三維圖形。結果：不同配比不同制法的30個樣品，均具有明顯的清除自由基活性，且表現出明顯的量效關系。水提液的協同作用范圍窄，幾乎成點狀分布，拮抗作用范圍呈6條寬窄不一的條帶狀分布；醇提液的協同作用呈小條狀分布，拮抗作用呈點狀分布。在先水提后醇提液協同作用呈條狀分布（3條），拮抗作用呈點狀分布。總之先水提后醇提液的協同作用區域大于醇提液，水提液次之；3種提取方法大部分區域均未表現出明顯協同與拮抗作用。結論：采用響應曲面分析法定量研究中藥配伍藥物相互作用，為相關研究提供了思路與方法的參考。

[關鍵詞] 當歸；川芎；藥對；抗氧化；DPPH；響應曲面分析法；相互作用

中醫多以數味中藥配伍形成的方劑為載體治療疾病[1]。配伍是中藥用方的靈魂。藥有個性之特長，方有合群之妙用，藥物的聯合使用才能產生藥物的相互作用，主要表現在效應的強度、毒性以及作用時間上的一些變化。兩藥配伍后可產生相加性、協同性或拮抗性藥物相互作用[2]。研究方法有定性的輻射分析法、分數分析法、概率分析法和定量的響應曲面分析法等[3]。

當歸-川芎為臨床常用藥對，歷史上許多著名的方劑均是由這2味藥物組成，歷代許多婦科良方如四物湯及其類方均含有這2味藥，但由于不同的配伍比例，使得這些方劑產生了不同的功效及臨床主治[4]。現代藥理學研究表明歸芎藥對具有抗氧化作用[5-6]，氧自由基涉及歸芎所應用的婦科、內科以及養生等多個領域的病理機制。因此，實驗室在前期研究工作基礎上[7-17]，選擇對DPPH體外抗氧化模型的影響作為評價指標，比較當歸和川芎10種配比（1∶0，1∶0.176，1∶0.364，1∶0.577，1∶0.839，1∶1.192，1∶1.732，1∶2.747，1∶5.67，0∶1）與3種提取方法（水提取模擬水煮，50%醇提取模擬酒水煎煮，先水提再95%醇提近似模擬散劑）的提取液的體外抗氧化活性差異，并采用響應曲面分析法，研究當歸-川芎體外抗氧化相互作用與量效關系，為揭示當歸-川芎藥對的配伍用藥規律提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根，來源于甘肅岷縣當歸GAP種植基地；川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，來源于四川彭州川芎GAP種植基地，并經南京中醫藥大學嚴輝博士鑒定。基于響應曲面分析藥物相互作用要求，采用Short等[18]提出的輻射（radial slices）設計，將二維坐標平均分成9等分，即得10個歸芎藥對配比（1∶0，1∶0.176，1∶0.364，1∶0.577，1∶0.839，1∶1.192，1∶1.732，1∶2.747，1∶5.67，0∶1）。對歸芎藥對不同配比混合藥材分別進行熱回流水提取、熱回流50%醇提取和先水提再用95%醇提，得到相應樣品（W-1～W-10，A-1～A-10，WA-1～WA-10），冷藏備用。DPPH（2，2-二苯基-1-苦肼基）購自Sigma-Aldrich公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 A-5002酶標儀（奧地利TECAN公司）；FA1104N精密天平（上海精密科學儀器有限公司）；EPED-T型超純水器（南京易普易達科技有限公司）。

1.3 DPPH自由基清除能力測定法 DPPH清除率的測定[19]，在96孔板中加入不同提取方法不同配比不同濃度的歸芎藥對100 μL，終濃度含生藥量分別為0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16 g·L^-1。加入各樣品受試藥物后，溶于含0.1 g·L^-1 DPPH的100 μL無水乙醇溶液，避光反應30 min后在517 nm波長下測定其吸光度為A0。同時作空白對照，在517 nm波長下測定其吸光度為A₁。為扣除藥物本底顏色對實驗的影響，在加入藥物后加入無水乙醇在517 nm波長下測定其吸光度A2。每個樣品重復6次，按照下式計算各樣品受試藥物對DPPH清除率：A₁-（A₀-A₂）/A₁×100%，并計算IC₅₀（指DPPH的抑制率為50%時的提取物溶液濃度），IC₅₀越小，抗氧化活性越高。

2 結果

2.1 歸芎藥對不同比例、不同提取方法的IC₅₀ 不同比例、不同制備方法得到的樣品抗氧化能力有所不同。其中，水提液1∶1.192配比最優，1∶0，0∶1配比效果最差；醇提液1∶5.67配比最優，1∶0配比效果最差；先水提后醇提1∶5.67配比最優，1∶1.73配比效果最差，見表1。

2.2 模型參數加合構建響應曲面 本研究應用響應曲面分析法探討當歸-川芎藥對對DPPH自由基的抗氧化作用的藥效學相互作用規律。由于中藥中多成分多靶點的共同作用，本文研究中采用二次多項式來更好的描述兩藥合用的量效曲線，并以合并指數來描述兩藥的相互作用強度。為了便于繪圖，將合并指數減1，以0作為典型的加和作用。

根據結果得出不同提取方法不同配比當歸-川芎的IC₅₀，求算出U_DG和U_CX （U_DG=當歸實際用量/IC₅₀，DG；U_CX=川芎實際用量/IC₅₀，CX），U_DG +U_CX=U，以U/ IC₅₀（不同配比）為橫坐標，E_清除率表示不同濃度的清除率，以E_清除率/（1-E_清除率）為縱坐標，應用非線性回歸的方法確定量效曲線的各個參數，見表1，方程為y=ax^b，建立三維響應面模型，應用Matlab軟件構建響應曲面的三維圖形。

2.3 當歸-川芎藥對相互作用的評價 在三維響應面模型中，顏色的深淺代表了該點處2藥相互作用的強度。根據合并指數的計算方法，當指數接近于0時，提示藥物間為相加作用；大于1時，提示藥物間為拮抗作用，小于1時為協同作用。指數值越高，表示相互作用的強度越大，在圖中表現為顏色越接近于紅或藍兩端。X軸表示不同劑量濃度的U_當歸（U_當歸=當歸實際用量/IC₅₀，_DG），Y軸表示不同劑量濃度的U川芎（U川芎=川芎實際用量/IC₅₀，_CX），Z軸表示歸芎藥對在不同劑量下的清除率，由X，Y，Z軸形成的三維空間區域表示不同比例當歸-川芎藥對的效應值形成的曲面圖（局部截面圖中參數所代表的是U_當歸，U川芎，效應值強度，相互作用強度）。

2.4 歸芎藥對水提液的相互作用 在歸芎藥對水提液的響應曲面圖1中A，協同作用范圍窄，幾乎成散點狀分布，拮抗作用成條狀分布，約6條，寬窄不一，大部分均未表現出明顯協同與拮抗作用。圖1中B（0.10，0.30，0.44，-1.00）的點作為協同作用最強的點，得質量濃度為0.59 g·L^-1，配比為1∶1.44。圖1中C（1.00，20.00，0.76，1.00）的點作為拮抗作用最強的點，得質量濃度為26.82 g·L^-1，歸芎配比為1∶9.56。

2.5 歸芎藥對醇提液的相互作用研究 在歸芎藥對醇提液的響應曲面圖2中A，協同作用呈小條狀分布，拮抗作用呈散點分布，而超過90%均未表現出明顯協同與拮抗作用。圖2中B（0.01，0.10，0.31，-1.00）的點作為協同作用最強的點，得質量濃度為0.12 g·L^-1，配比為1∶2。圖2中C（0.40，0.10，0.80，1.00）的點作為拮抗作用最強的點，得質量濃度為1.64 g·L^-1，歸芎配比為22.42∶1。

2.6 歸芎藥對先水提后醇提的相互作用研究 在歸芎藥對先水提后醇提液的響應曲面圖3中A，協同作用呈小條狀分布，有3條，拮抗作用呈散點分布，而超過50%均未表現出明顯協同與拮抗作用。圖3中B（0.10，1.70，0.62，-1.00）的點作為協同作用最強的點，得質量濃度為2 g·L^-1，配比為1∶10.76。圖3中C（0.2，0.10，0.12，1.00）的點作為拮抗作用最強的點，得質量濃度為0.45 g·L^-1，歸芎配比為1∶0.32。

3 討論

近年來國內外研究表明，癌癥、糖尿病、心腦血管等多種疾病與自由基導致的生物大分子氧化損傷有關。自由基是人體進行生命活動時產生的一種活性分子，在正常代謝過程中，自由基的產生和清除處于動態平衡，在某些病理情況下，這種平衡被打破，機體產生的自由基不能被及時消除，致使機體損傷，導致疾病發生。DPPH在有機溶劑中是一種穩定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可見光區最大吸收峰為517 nm，當DPPH溶液中加入自由基清除劑時，孤對電子被配對，吸收減弱或消失，其褪色程度與其接受的電子數成定量關系，可用來檢測自由基的清除情況，評價某物質的抗氧化能力。其能力用清除率來表示，清除率越大，表示抗氧化能力越強[20]。本實驗采用DPPH法考察不同配比不同濃度不同提取方法的歸芎藥對抗氧化能力，然后應用非線性回歸的方法確定量效曲線的各個參數，建立三維響應面模型，應用Matlab軟件構建響應曲面的三維圖形。

結果顯示，當歸-川芎不同配比不同制法具有不同的抗氧化活性。通過分析響應曲面發現先水提后醇提的協同作用區域大于醇提液，水提液次之，可能是由于當歸-川芎合并先水提后醇提能使更多抗氧化成分溶出增加。

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Study on antioxidant interaction of different preparations and

proportions of Danggui-Chuanxiong drug pair

HUANG Mei-yan， TANG Yu-ping*， SHANG Er-xin， GUO Jian-ming， LIU Xin，

WANG Lin-yan， LI Wei-xia， DUAN Jin-ao

（Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of Traditional Chinese Medicine Formulae，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China）

[Abstract] Objective： To observe the in vitro antioxidant interaction of different preparations and proportions of Danggui-Chuanxiong drug pair in the DPPH free radical scavenging rate with the response surface methodology. Method： The 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl （DPPH） free radical scavenging rate method was adopted for determining the antioxidant activity of extracts from Danggui-Chuanxiong with 10 proportions and three extraction processes. The response surface methodology was used to determine the parameters of the dose-effect curve and establish a three-dimensional response surface model. The three-dimensional response surface graph was constructed with Matlab software. Result： All of the 30 samples with different proportions and preparations had antioxidant effect in scavenging free radicals and a remarkable dose-effect relationship. Their water extracts had a narrow synergistic range， with only spot distribution. Their antagonist ranges were districted in six bands of various widths. The synergistic ranges of ethanol extracts were districted in small bands， with the antagonist ranges scattered in points. The synergistic ranges of their water-alcohol extracts were distributed in three bands， with their antagonist ranges scattered in points. In short， the water-alcohol extracts showed a wider synergistic range than ethanol extracts， followed by water-extracts. All of the three extraction processes showed no obvious synergistic and antagonist effects. Conclusion： The quantitative study on the interaction of traditional Chinese medicines with different compatibilities with the response surface methodology provides reference of thoughts and methods for relevant studies.

[Key words] Danggui； Chuanxiong； drug pair； antioxidant effect； DPPH； response surface methodology； interaction

doi：10.4268/cjcmm20130218

[責任編輯 張寧寧]