含卟啉基團小分子釓配合物的合成與表征

鄢國平，鄒頭君，邵春桃，李 貞，常秀鵬

（武漢工程大學材料科學與工程學院，湖北 武漢 430074；武漢工程大學綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074）

0 引 言

在臨床醫學診斷中，腫瘤的及時、準確的發現對治療起著至關重要的作用［1－2］．磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）技術是當前用于腫瘤檢測與診斷的先進影像技術之一．磁共振成像造影劑（MRI contrast agent）能縮短體內局部組織中水質子的弛豫時間，提高成像對比度和清晰度［3］，可有效地區分病變組織與正常組織的差異，有利于進行疾病的早期診斷，這樣不僅能夠及時準確的對癥下藥，進行早期治療，而且還能在很大程度上提高治療效果，提高患者的治愈率和存活率．

二乙三胺五乙酸釓（Gd－DTPA）是目前臨床上應用最廣泛的MRI造影劑，在體內主要循環于組織細胞外液間，沒有特定的生理分布，因此Gd－DTPA在體內分布沒有生物學專一性（靶向性）．另外，由于Gd－DTPA是以鈉鹽或葡甲胺鹽的形式應用于臨床，為離子型造影劑，故有滲透壓偏高的問題，這些高濃度的釓類對比劑還不可避免地產生諸如腎系統纖維化（NSF）等毒性反應［4－5］．因此，在造影劑的基本骨架上引入各種靶向基團進行化學修飾，制備得到非離子型配合物，不僅可賦予造影劑組織或器官的靶向性，而且可降低造影劑的滲透壓、毒副作用［6－8］．卟啉及其金屬配合物對腫瘤具有特異的親和性，注射入人體后會在腫瘤組織富集，因此卟啉化合物可用作為造影劑的腫瘤靶向基團［9－14］．

本研究用5－（4－氨基苯基）－10，15，20－三吡啶基卟啉對DTPA基本骨架進行化學修飾，合成一種小分子配體二乙三胺三乙酸二酰（5－（4－氨基苯基 ）－10，15，20－三 吡 啶 基 卟 啉 ）（DTPA－2APTMPyP），再與金屬釓離子Gd（Ⅲ）配合，從而制備小分子造影劑二乙三胺三乙酸二酰（5－（4－氨基苯基）－10，15，20－三吡啶基卟啉）釓配合物（Gd－DTPA－2APTMPyP），其具體合成路線如圖1．并對所合成的配體及其配合物進行了FT－IR、UV、1 H NMR等結構表征，進一步研究了造影劑的體外弛豫性能與細胞毒性實驗．

圖1 腫瘤靶向造影劑（Gd－DTPA－2APTMPyP）的合成路線Fig．1 Synthetic route of tumor－targeting MRI contrast agent（Gd－DTPA－2APTMPyP）

1 實驗部分

1．1 試劑及儀器

二乙三胺五乙酸（DTPA）、4－硝基苯甲醛、4－吡啶甲醛、乙酸酐、氧化釓、濃鹽酸、碘甲烷、無水乙醇、無水甲醇、無水乙醚、丙酸、三氯甲烷、二氯甲烷均為分析純試劑；N，N－二甲基甲酰胺（DMF）用Ca H2干燥48 h后蒸餾備用．吡咯、吡啶用前蒸餾．

1H NMR用Varian Mercury VX－300型核磁共振波譜儀于300 MHz下測定；FT－IR用Nicolet Imapct 420型傅里葉紅外分析儀測定，KBr壓片；UV用 UNIC－2802 H UV／Vis Spectrophotometer紫外光譜測定；熔點用北京光電科學儀器廠XT4－100x顯微熔點儀（數字顯示，溫度校正）測定；自旋－晶格弛豫時間（T 1）用 Varian Mercury－Vx300 NMR（300 MHz）核磁共振測定．

1．2 配體及配合物的合成

1．2．1 配體 DTPA－2APTPyP 二乙三胺五乙酸雙酸酐（DTPAA）參照文獻［15－16］方法制備，5－（4－氨基苯基）－10，15，20－三吡啶基卟啉參照文獻［17］方法制備．將0．8 g 5－（4－氨基苯基）－10，15，20－三吡啶基卟啉（1．28 mmol）加入到盛有20 m L DMF的燒瓶中，在冰浴磁力攪拌的條件下，緩慢加入0．20 g DTPA 雙酸酐（0．64 mmol），低溫反應8 h后，室溫下繼續反應24 h．用無水乙醚沉淀，過濾干燥，收集固體．再用DMF－無水乙醚重沉淀，真空干 燥，即 得 配 體 DTPA－2APTPyP 0．64 g，產率：81%．

1．2．2 釓配合物 Gd－DTPA－2APTMPyP的制備

將0．6 g DTPA－2APTPyP（0．36 mmol）溶于20 m L DMF中，攪拌緩慢加入0．16 g CH3I（1．08 m L），40℃下反應4 h．加入200 m L無水乙醚，產生紅褐色沉淀．過濾，再用DMF－無水乙醚進行重沉淀，真空干燥，即得配體 DTPA－2APTMPyP 0．44g，產率74%．

將0．3 g配體DTPA－2APTMPyP（0．14 mmol）溶于8 m L甲醇中，攪拌緩慢加入0．045 g GdCl3·6 H2O（0．14 mmol），室溫下反應2 h．用甲醇－無水乙醚重沉淀，過濾，乙醚洗滌，干燥，得到深褐色固體，即金屬配合物 Gd－DTPA－2APTMPyP 0．255 g，產率85%．

1．3 釓配合物弛豫時間的測定

將釓配合物 Gd－DTPA－2APTMPyP 溶于二次蒸餾水中，配成濃度為0．1、0．3、0．5、0．7、0．9、1．1 mmol／L的溶液；同樣上述方法，配制濃度為0．15 mmol／L的 Gd－DTPA溶液．調節至p H 7～8，以返轉回復法在Varian Mercury－VX300 NMR（300 MHz）核磁共振儀上測定溶液中質子的自旋－晶格弛豫時間T1，并計算弛豫率．

1．4 釓配合物體外細胞毒性實驗

用培養液調節He La細胞濃度為60 000～80 000個／毫升，取96孔培養板加樣，每孔100μL（6 000～8 000個／孔），在37℃，體積分數5%的CO2培養箱中培養24 h．待HeLa細胞長滿孔底之后去掉培養液，加入含不同濃度的小分子釓配合物（Gd－DTPA－2APTMPyP 或者 Gd－DTPA）的新鮮培養液，對照組則加入不含釓配合物的新鮮培養液．繼續培養48 h．用培養液洗滌一次，加入100μL的培養液、四甲基偶氮唑鹽（MTT）溶液（5．0 mg／m L，20μL／孔），繼續培養4 h．棄去上清液，以3%小牛血清－磷酸緩沖鹽水洗二次，傾干液體，加入100μL二甲基亞砜（DMSO），搖勻，室溫放置30min．以無細胞空白孔為零點，選取5個平行樣，測量OD570值，計算細胞相對存活率．

2 結果與討論

2．1 紅外表征

配體和配合物的紅外光譜圖如Fig．1，配體DTPA－2APTMPy P在3 436 cm－1為υN－H和υOH的疊加，1 653 cm－1和1 624 cm－1為酰胺鍵和羧酸根中的υC＝O；配合物Gd－DTPA－2APTMPyP在1 653 cm－1和1 624 cm－1消失，藍移至1 593 cm－1，說明配體在形成配合物后羧酸根和酰胺鍵中的羰基與金屬離子發生了配位作用．

圖2 DTPA－2APTMPyP和 Gd－DTPA－2APTMPyP的紅外光譜圖Fig．2 FT－IR spectra of DTPA－2APTMPyP and Gd－DTPA－2APTMPyP

2．2 紫外表征

配體和配合物的紫外光譜圖如圖3、4．在紫外可見光譜中，卟啉化合物特殊的化學結構，表現在Soret帶有一個很強的吸收峰；在可見光區存在4個較弱的Q吸收帶．

由圖3可知配體DTPA－2APTMPyP的紫外吸收峰為λmax：427，515，558，590，654 nm；由Fig．4可知配合物Gd－DTPA－2APTMPyP的紫外吸收峰為λmax：419，510，549，587，644 nm．對比可得：配合物的Q帶吸收峰存在一定程度的藍移，這是由于配體與Gd配合，溶液的極性增強造成的．

圖3 DTPA－2APTMPyP的紫外圖譜Fig．3 UV－Vis spectrum of DTPA－2APTMPyP

圖4 Gd－DTPA－2APTMPyP的紫外圖譜Fig．4 UV－Vis spectrum of Gd－DTPA－2APTMPyP

2．3 核磁共振表征

配體DTPA－2APTPyP的核磁圖譜（圖5）的吸收峰（化學位移）和各自歸屬為：1 H NMR（d6－DMSO，δ，ppm）：9．49（d，6 H，meta－pyridine），9．21（d，2 H，β－pyrrole），9．13（d，4 H，β－pyrrole），9．00（d，2H，β－pyrrole），8．48（s，1 H，amino），8．43（m，2 H，aminophenyl），8．15（m，6 H，orthophenyl），4．71（m，6 H，NCH3），3．10（s，4 H，2×CH2—COOH），2．97（m，4H，2×CH2—CO—NH），2．90（t，4 H，2×N—CH2），2．73（s，2 H，CH2COOH），2．67（t，4 H，2×N—CH2）．

圖5 DTPA－2APTPyP的核磁圖譜Fig．5 1 H NMR spectrum of DTPA－2APTPyP

2．4 釓配合物對水質子弛豫性能的影響

順磁性MRI造影劑通過增強水質子的弛豫效率從而提高磁共振成像的效果，本實驗表現為增強其對溶劑中水質子的弛豫速率，用自旋－晶格弛豫率R1表示提高磁共振成像的效果，由下式表示：

上式中（1／T1）obsd和（1／T1）d分別為有順磁性物質存在時觀察到水質子的縱向弛豫速率及作為空白樣的純水中質子的弛豫速率．R1溶液中順磁性物質的弛豫率、［M］為溶液中順磁性物質的摩爾濃度．當R1值越大時表明其弛豫能力越強，即對水質子的弛豫影響更大，活體的成像效果更好．

表1為釓配合物 Gd－DTPA－2APTMPyP在不同濃度（0．1～1．1 mmol／L）的水溶液中所測得的溶劑水分子氫核縱向弛豫時間T1，以及所計算出的相對應的弛豫速率A，即1／T1．

圖6 Gd－DTPA－2APTMPyP在水溶液中的弛豫性能Fig．6 Relaxivity of Gd－DTPA－2APTMPyP in water solution

由Table 1的數據作圖（圖6），從圖中可知隨著配合物濃度的變化，溶劑中水分子中質子的弛豫速率A呈線性變化．其中橫坐標X為水溶液中配合物Gd－DTPA－2APTMPyP的摩爾濃度，縱坐標Y為縱向弛豫時間T1的倒數，即弛豫速率．

表1 弛豫率數據Table 1 Experimental data of relaxivity

根據圖6的趨勢線做線性擬合，相關系數為0．999，得下式

對照上式，可見 Gd－DTPA－2APTMPyP的弛豫率為4．798 mmol－1·L·s－1，該值高于 Gd－DTPA的弛豫率（3．687 mmol－1·L·s－1）．

實驗結果表明，Gd－DTPA－2APTMPy P 對水質子的弛豫速率有較好的加速作用，弛豫率較高，有利于獲得良好的成像效果．

2．4 釓配合物的細胞毒性實驗

從圖7可知，當培養液中釓配合物質量濃度為5μg／m L時，用含 Gd－DTPA培養液培養的HeLa細胞的相對存活率為89%，而用含Gd－DTPA－2APTMPyP培養液培養的 HeLa細胞的相對存活率為89．8%；當培養液中釓配合物質量濃度為100μg／m L時，用含Gd－DTPA培養液培養的He La細胞的相對存活率為73%，而用含Gd－DTPA－2APTMPyP培養液培養的 HeLa細胞的相對存活率為60．0%．

圖7 釓配合物對HeLa細胞的體外毒性Fig．7 In vitro cytotoxicity assay of the gadolinium complex to HeLa cells

3 結 語

用二乙酸酐五乙酸（DTPA）脫水制得二乙酸酐五乙酸雙酸酐（DTPAA），再與卟啉化合物進行反應，合成小分子配體，然后與金屬釓離子進行配合制得水溶性小分子造影劑．對所得的配體和配合物進行結構表征與體外性能研究．實驗結果表明，與Gd－DTPA相比，這類小分子磁共振成像造影劑具有較高的弛豫率，對He La細胞具有相似的體外細胞毒性．將進一步研究小分子造影劑的腫瘤靶向性能與體內外磁共振成像性能．

致謝

感謝國家自然科學基金委、武漢市科技攻關計劃項目組、武漢工程大學第三屆研究生創新基金組的資助．

［1］陳小華，潘慶春．PTD－HBc Ag融合蛋白經樹突狀細胞誘導特性CTL抑制HBV的體外研究［J］．細胞與分子免疫學雜志，2009，25（4）：289－292．

［2］湯俊琦，黃嘉敏．納米金在腫瘤診斷中的應用［J］．材料導報，2012，26（9）：59－64．

［3］Fries P，Runge V M，Bqucker A，et al．Brain tumor enhancement in magnetic resonance imaging at 3 tesla：intraindividual comparison of two high relaxivity macromolecular contrast media with a standard extracellular Gd－chelate in rat brain tumor modal［J］．Invest Radiol，2009，44（4）：200－206．

［4］黃素英，張婷．冠脈造影劑腎病水化干預護理探討［J］．護士進修雜志，2011，26（8）：698－700．

［5］王兆星．造影劑腎病早期診斷的生物標志物［J］．腎臟病與透析腎移植雜志，2011，20（3）：275－279．

［6］Yan G P，Zhuo R X．Liver－targeting macromolecular MRI contrast agents［J］；Science in China：Series B，2001，44（4）：344－352．

［7］Yan G P，Liu M L．Polyaspartamide Gadolinium Complexes Containing Sulfadiazine Groups as Potential Macromolecular MRI Contrast Agents［J］．Bioconjugate Chem，2005，16（4）：967－971．

［8］Yan G P，Ai C W，Li L，et al．Dendrimers as Carriers for Contrast Agents in Magnetic Resonance Imaging［J］．Chinese Science Bulletin，2010，55（27／28 ）：3237－3243．

［9］侯長軍，郝燕，霍丹群．卟啉及其衍生物抗癌活性機理研究進展［J］．生物醫學工程研究，2007，26（1）：97－100．

［10］Shahbazi－Gahrouei D，Williams M，Rizvi S，et al．In Vivo Studies of Gd－DTPA－monoclonal Antibody and Gd－porphyrins：Potential Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents for Melanoma［J］．J Magn Reson Imaging，2001，14：169－174．

［11］Young S W，Sidhu M K，Qing F．Preclinical Evaluation of Gadolinium （III）Texaphyrin Complex：a New Paramagnetic Contrast Agent for Magnetic Resonance Imaging［J］．Invest Radiol，1994，29：330－338．

［12］Hofmann B，Bogdanov A，Marecos E，et al．Mechanism of Gadophrin－2 Accumulation in Tumor Necrosis［J］．J Magn Reson Imaging，1999，9：336－341．

［13］石偉民 ，劉衛敏 ，陶京朝．用于光動力治療的四苯基卟啉衍生物研究進展［J］．化學研究，2005，16（2）：101－105．

［14］Yan G P，Li Z，Xu W，et al．Porphyrin－containing Polyaspartamide Gadolinium Complexes as Potential Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents［J］．International Journal of Pharmaceutics，2011，407：119－125．

［15］張麗民，陳杞．螯合劑DTPAA的合成及應用［J］．化學世界，1992，33（2）：70－72．

［16］Hnatowich D J，Layne W W．The preparation and labeling of DTPA－coupled albumin［J］．Int J Appl Radiat Isot，1982，33（5）：327－332．

［17］Dong－Fang S，Richard T W，Daekyu S，et al．Laurence H． Hurley． Quadruplex－Interactive Agents as Telomerase Inhibitors：Synthesis of Porphyrins and Structure－Activity Relationship for the Inhibition of Telomerase［J］．J Med Chem，2001，44（26）：4509－4523．