黑豆過氧化物酶的酶學特性研究

安徽農業大學生命科學學院 張寬朝 阮飛 李成 文漢＊

黑豆為豆科植物的種子，含有豐富的蛋白質、卵磷脂、脂肪、維生素、黑色素及煙酸等，具有醫食同療的重要生理功能（王敏等，2008）。過氧化物酶（POD）是一類廣泛存在于各種植物、動物和微生物體內的氧化還原酶，能夠催化過氧化氫和有機過氧化物對各種有機物和無機物的氧化作用，參與細胞代謝的氧化還原過程（羅龍海等，2008；田國忠和李懷芳，2001）。本試驗對黑豆中的過氧化物酶進行酶學特性的研究，以期為進一步研究過氧化物酶的基本特性、調控黑豆的加工過程、拓展過氧化物酶的獲取渠道提供理論參考和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 黑豆：廬州黑豆，市售，粉碎機破碎，備用；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、愈創木酚、EDTA、Tris、氫氧化鈉、氯化鈉、考馬斯亮藍 G-250等均為國產分析純；SP-722E分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、TGL-20M臺式高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）、MC99-3自動液相色譜分離層析儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）、粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 POD酶活性測定及活性單位 采用愈創木酚法測量酶活力。此方法主要是利用有過氧化氫存在條件下，POD能使愈創木酚氧化，生成茶褐色物質，該物質在470 nm處有最大光吸收，測量吸光度值并計算酶活力。

POD活性測定參考文獻的方法，略有不同（Amako等，1994）。測定系統為4 mL，包括l mL 40 mmol/L 愈創木酚，l mL 40 mmol/L H202，1.9 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH6.O），30℃水浴預熱。加入0.1 mL酶液于30℃反應5 min，波長470 nm下測定OD值。

POD活力單位定義為 ：每分鐘OD值變化0.001為一個酶的活力單位（U）。

1.2.2 酶學特性研究

1.2.2.1 粗酶液的提取 準確稱取豆殼粉末4 g，放入研缽，放少許石英砂，加入0.2 mol/L pH值為6.0的磷酸緩沖液160 mL進行研磨，室溫下抽提24 h后，將粗提液經脫脂紗布過濾，再經10000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2.2 酶的最適pH 按1.2.1酶活測定體系，分別加入 pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、40 mmol/L 愈創木酚，40 mmol/L H202，搖勻，30℃水浴預熱，加入酶液，于30℃恒溫反應5 min，迅速取出測定酶活性，繪圖確定酶的最適pH。

1.2.2.3 酶的最適溫度 按1.2.1酶活測定體系，分別加入40 mmol/L愈創木酚，40 mmol/L H2O2，0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH6.O），搖勻，30 ℃水浴預熱，加入酶液，分別于 25、30、35、40、45、50 ℃準確恒溫反應5 min，迅速取出測定酶活性，繪圖確定酶的最適溫度。

1.2.2.4 愈創木酚濃度對酶反應的影響及其表觀Km 在最適溫度下，分別加入5、10、20、40 mmol/L愈創木酚，40 mmol/L H2O2，0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH6.O），搖勻，30 ℃水浴預熱，加入酶液，準確恒溫反應5 min，迅速取出測定酶活性，按Lineweave Burk法采用雙倒數法作圖。

1.2.2.5 過氧化氫濃度對酶反應的影響及其表觀Km 在最適溫度下，分別加入40 mmol/L愈創木酚，0.5、1、5、10、20、40 mmol/L H2O2，0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH6.O），搖勻，30℃水浴預熱，加入酶液，準確恒溫反應5 min，迅速取出測定酶活性，按Lineweave Burk法采用雙倒數法作圖。

1.2.2.6 金屬離子對POD活性的影響 按1.2.1酶活測定體系， 分別加入 0.5、1.0、1.5、3.0 mg/mL含 MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、AlCl3、NaCl、KCl 0.2 mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液，40 mmol/L愈創木酚，40 mmol/L H202，搖勻，30 ℃水浴預熱，加入酶液，恒溫反應5 min，迅速取出測定酶活性。

1.2.2.7 常見化合物對POD活性的影響 按1.2.1酶活測定體系分別加入0.5、1.0、1.5 mg/mL含抗壞血酸（維生素C）、檸檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）0.2 mol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液，40 mmol/L愈創木酚，40 mmol/L H202，搖勻，30℃水浴預熱，加入酶液，恒溫反應5 min，迅速取出測定酶活性。

1.3 數據處理與分析 試驗數據以Excel 2003作圖。

2 結果與分析

2.1 POD最適pH 由圖1可見，隨著緩沖液pH逐漸增大，黑豆POD的活性呈先升高后降低的趨勢，pH為5.0時酶活最高，因此POD的最適pH為5.0，，在酸性范圍內。這與蓮藕、枇杷果肉、小麥種子POD的最適pH相同，與甘蔗苗、豆殼和草莓果實、荔枝果皮POD最適pH相近（龐學群和段學武，2004）。

2.2 POD最適溫度與溫度耐受性 從圖2可見，溫度為20～30℃時，酶活性隨著溫度的升高而逐漸上升，究其原因可能是，適度提高溫度，有利于酶朝著有利于底物發生作用的催化構象轉變。當溫度為30℃時，黑豆POD的酶活性最高。隨著溫度的進一步升高，會破壞酶的活性構象，酶活性呈不斷下降的趨勢。因此，黑豆POD的最適反應溫度是30℃，比蓮藕、荔枝果皮和枇杷果肉、豆殼、小麥種子略低，但與草莓果實一致 （王志兵等，2010；羅龍海等，2008；闕瑞琦等，2007；龐學群和段學武，2004）。

2.3 黑豆POD Km 由圖3可見，Km即為直線在X負軸上截距的負倒數。根據計算可得：黑豆過氧化物酶對愈創木酚和過氧化氫的表觀Km值分別為0.49 mmol/L和0.62 mmol/L，說明，黑豆的POD與愈創木酚和過氧化氫的親和力較大。

2.4 金屬離子對POD活性的影響 以磷酸鹽緩沖液內含金屬離子作為反應體系，測定不同金屬離子對黑豆POD活性的影響，結果見圖4。從圖4可見，在供試濃度范圍內，外源Cu2+的加入，均能夠激活 POD 酶活性， 而 Mg2+、Al3+、K+、Na+對酶活性均有一定程度的抑制作用。

2.5 化合物對POD活性的影響 以磷酸鹽緩沖液內含抗壞血酸（維生素C）、檸檬酸、EDTA、EDTANa24種常見POD化合物作為反應體系，測定不同化合物對黑豆POD活性的影響，結果見圖5。從5圖可見，在供試濃度范圍內，抗壞血酸、檸檬酸、EDTA、EDTA-Na2均對黑豆POD活性具抑制作用。

3 結論

試驗針對黑豆中對豆乳粉、豆奶營養價值和感官質量影響均較大的過氧化物酶進行了酶學特性的研究，以期為黑豆產品的深加工和綜合利用與開發提供理論參考。結果表明，POD最適pH為5.0，最適反應溫度30℃，對愈創木酚和過氧化氫的表觀Km值分別為0.49 mmol/L和0.62 mmol/L，在供試濃度范圍內，Cu2+可激活POD酶活性，Mg2+、Al3+、K+、Na+對酶活性有抑制作用，而維生素C、檸檬酸、EDTA、EDTA-Na2均是黑豆POD的抑制劑。

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