自噬參與DJ-1保護大鼠黑質多巴胺能神經元抵抗魚藤酮損傷

劉慧豐 楊巍巍 高 華 楊 慧*

(1.北京王府中西醫結合醫院綜合內科，北京 100049;2.首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系北京腦重大疾病研究院，北京 100069;3.首都醫科大學附屬北京天壇醫院北京神經外科研究所，北京 100050)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種以運動障礙為主要臨床特征的復雜的神經退行性病變。目前，PD的確切病因尚不明了，但許多研究［1-2］傾向PD的發生是遺傳和環境因素共同作用的結果。

DJ-1是個多功能蛋白，其基因突變可能導致PD發生。有研究［1］表明過表達野生型DJ-1可抵抗氧化應激引起的損傷。而敲除DJ-1后可增加細胞或動物模型對氧化應激損傷的敏感性［2-3］。另外，RNA干擾試驗證實DJ-1可以抑制用百草枯處理的SH-SY5Y細胞的自噬囊泡生成，增加了細胞凋亡數量［3］。

魚藤酮作為廣泛使用的脂溶性殺蟲劑，是較明確的線粒體復合物I抑制劑，可以引起氧化應激和細胞凋亡［4］。持續、低劑量的經頸靜脈或皮下給予魚藤酮被證明能選擇性損傷黑質多巴胺能神經元［5］。但是，目前DJ-1是否降低魚藤酮所致多巴胺能神經元損傷及其具體機制目前尚不清楚。因此，闡明DJ-1對于多巴胺能細胞的保護機制，有助于為防治PD提供可能的藥物靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1)試劑:RIPA裂解液(北京普利萊基因技術有限公司);LC3抗體(Abcam公司);actin抗體(Sigma公司);TH抗體(Sigma公司);DJ-1抗體(Chemicon公司);beclin1抗體(Proteintech Group公司);phospho-mTOR抗體 (Cell Signaling公司)，mTOR抗體(Cell Signaling公司)，2種腺相關病毒是由帶綠色熒光蛋白(GFP)標簽和人源的DJ-1基因及其空載體分別構建而成，它們分別為LV-GFP-DJ-1和空載對照LV-GFP(由上海吉凱基因技術有限公司提供技術服務);魚藤酮(Sigma公司);水合氯醛購于中國沈陽試劑廠，HRP標記的二抗購于KPL公司，2種腺相關病毒攜帶人源DJ-1及其空載體分別為AAVr-DJ-1(DJ-1)和空載對照AAVr-LacZ(LacZ)，由本實驗室自己構建。

2)動物:成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體質量230～250g，等級:SPF，醫學實驗動物質量合格證書，許可證編號:SCXK(京)2012－0001，首都醫科大學實驗動物部提供。

1.2 方法

1)實驗分組:采用數字表法隨機將114只SD雄性大鼠分為6組，假手術組(20只):單純切開頭皮，顱骨鉆孔后縫合皮膚作為假手術組;實驗組1(30只):注射攜帶DJ-1基因的腺相關病毒(AAVr-DJ-1，DJ-1);對照組1(22只):注射攜帶LacZ基因的腺相關病毒(LacZ)作為空載體對照組1;實驗組2(10只):注射攜帶GFP-DJ-1基因的腺相關病毒(GFP-DJ-1);對照組2(10只):注射攜帶GFP基因的腺相關病毒(GFP);對照組3(22只):注射0.9%的氯化鈉注射液(NS)。

腺相關病毒感染后4周，實驗組和對照組共5組動物均于黑質紋狀體通路內側前腦束注射魚藤酮;假手術組注射等劑量的DMSO混合溶液。

手術后4周，105只大鼠存活(其中實驗組1為27只，對照組1為21只，實驗組2為8只，對照組2為9只，對照組3為20只，假手術組3為20只)。不同時間點不同組別各檢測指標的動物數情況詳見表1。

表1 手術后4周各組實驗動物數Tab.1 Number of animals underwent different treatment methods at 4 weeks after operation

2)大鼠腦定位注射腺相關病毒及魚藤酮:SD大鼠用6%的水合氯醛腹腔注射麻醉，按6 m L/kg注射。將麻醉好的大鼠固定在腦立體定位儀上，消毒開皮，暴露顱骨。腺相關病毒注射到大鼠左側黑質，注射位點為前囟后(－)5.2 mm，正中線左旁開(L)2.0 mm，硬腦膜下(V)7.5 mm，門齒棒低于耳間線(－)2.4 mm，魚藤酮注射到黑質紋狀體通路內側前腦束，注射位點為前囟后(－)4.4 mm，正中線左旁開(L)1.1 mm，硬腦膜下(V)7.9 mm，門齒棒低于耳間線(－)2.4 mm。在手術顯微鏡下立體定位上述注射位點，用牙科鉆于相應的顱骨處小心鉆開一小孔，用Hamilton微量注射器，按1 μL/min的速度推進，每注射完1 μL的液體后，留針1 min，換點注射和注射完畢時，都需留針15 min，然后緩緩退出Hamilton微量注射器;于傷口處撒布少許AMP粉末，以消炎抗菌，然后全層縫合皮膚切口;將動物放置于溫暖的環境中直至大鼠蘇醒。腺相關病毒注射滴度為107TU，魚藤酮溶液濃度為1.5 mg/mL，溶劑為二甲基椏楓(DMSO)。

3)大鼠灌注取材及切片:SD大鼠用6%的水合氯醛注射麻醉，按6 mL/kg腹腔注射。0.9%的氯化鈉注射液沖洗血管，再用4%的多聚甲醛灌注固定，完畢后，取完整腦，去除小腦簾和大腦幕，放入4℃的4%的多聚甲醛溶液中繼續固定。24 h后，將腦組織放入30%的蔗糖PB溶液中4℃脫水2～3 d，即可用冰凍切片機(德國Leica)切片，腦片厚度為40 μm。

4)免疫組織化學染色:取SD大鼠黑質部位腦片(40 μm)，用0.01 mol/L PBS 洗3 遍，每次10 min，然后用0.3%PBST處理15 min。用5%山羊血清室溫孵育1 h，加入鼠源anti-TH抗體(1∶10 000)，或者抗兔源anti-DJ-1抗體(1∶1 000)4℃過夜，次日用PBS洗3次，加入相應的FITC標記的羊抗鼠(或兔)免疫球蛋白抗體(1∶500)，37℃避光孵育1 h，PBS沖洗3次，DAPI復染5 min，PBS沖洗3次，封片后用共聚焦掃描顯微鏡觀察。

5)Western blotting檢測:抽提SD大鼠黑質全細胞蛋白，選用RIPA蛋白裂解液進行細胞裂解，BCA法測蛋白濃度，SDS PAGE電泳，半濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜，8% 脫脂牛奶封閉1 h，分別入beclin1(1∶1 000)，mTOR(1∶1 000)，p-mTOR(1∶1 000)，LC3(1∶1 000)，actin(1∶5 000)抗體，4 ℃ 過夜。0.1%TBST洗膜3次，入相應辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔(或鼠)免疫球蛋白抗體中(1∶5 000)，室溫孵育1 h，洗膜同前。加入化學發光液，于暗室化學發光及顯影、定影。

1.3 統計學方法

使用SPSS for Windows11.5進行統計分析，實驗數據用均數±標準誤(E)表示，組間比較行單因素方差分析(One way ANOVA)，部分實驗數據行2×2析因方差分析。用Sigma-plot繪圖軟件作圖。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AAVr-DJ-1在大鼠黑質內的表達情況檢測

Confocal結果顯示腺相關病毒感染4周時，注射病毒側黑質部位可見DJ-1陽性細胞數顯著增加(圖1 A)，而對側僅有少量 DJ-1陽性細胞(圖1B)，證明AAVr-DJ-1成功在注射側黑質穩定大量表達。

2.2 DJ-1過表達緩解魚藤酮致大鼠黑質多巴胺能神經元損傷

魚藤酮損傷黑質4周后免疫熒光染色顯示，外源性DJ-1(綠色)可同時表達在神經元中及其他膠質細胞中。但是，約60%的外源性DJ-1表達在酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性神經元中(圖2)。

圖1 大鼠腦內注射AAVr-DJ-1病毒上清4周時黑質部位觀察DJ-1陽性細胞情況Fig.1 DJ-1 positive cells were observed following unilateral AAVr-DJ-1 injection into rats brain for 4 weeks

圖2 過表達DJ-1對黑質多巴胺神經元的影響Fig.2 The effect of DJ－1 overexpression on dopaminergic neurons in SN

在魚藤酮損傷4周后，比較各組SD大鼠損傷側黑質TH(紅色)與外源性DJ-1(綠色)陽性神經元數目。結果顯示，與假手術組(Sham)相比，單純魚藤酮注射組(Ro)大鼠黑質TH+神經元降低顯著;而過表達外源性DJ-1后，可顯著緩解魚藤酮所致DA能神經元丟失(圖2)。

行2×2析因方差分析，結果顯示，注射DJ-1后大鼠黑質TH陽性神經元數目較DJ-1注射之前增高，差異有統計學意義(P＜0.05);不考慮DJ-1注射這一因素時，注射Ro后大鼠黑質TH陽性神經元數目較Ro注射之前降低且差異有統計學意義(P＜0.05);DJ-1注射與Ro注射的交互作用對于大鼠黑質TH陽性神經元有顯著影響，即過表達DJ-1后可緩解Ro注射對于TH陽性神經元的損傷，差異有統計學意義(P＜0.05)(表 2，3)。

表2 DJ-1、魚藤酮注射前后大鼠黑質TH陽性神經元數目的描述Tab.2 Description of TH positive neuron numbers in the substantia nigra of rats with or without D J-1 or rotenone injected

表3 析因實驗結果的方差分析表Tab.3 Factorial experiment results of the ANOVA table

2.3 過表達DJ-1對自噬相關蛋白表達的影響

同LacZ組和NS組相比，魚藤酮損傷4周時，DJ-1組的 LC3-Ⅱ表達上調，差異有統計學意義(P＜0.05);而LacZ組與NS組比較，LC3Ⅱ/Ⅰ的比值差異無統計學意義(圖3)。

2.4 DJ-1對自噬通路PI3K/mTOR通路的影響

Western blotting結果顯示，與 NS、LacZ組相比，DJ-1過表達組的p-mTOR的水平降低(圖4A)，而Beclin1水平則明顯增加(圖4 B)。

3 討論

DJ-1是一種重要的保護性蛋白，在許多反應中發揮神經保護作用，如DJ-1基因缺陷增加對氧化應激的敏感性［6］;過表達野生型DJ-1，可保護神經元抵抗氧化應激［1，7］，提高 HSP70的表達水平，抑制突變型α-SYN A53T引起的蛋白聚集和細胞毒性［8-9］。本課題組以前的研究［10］發現，過表達DJ-1可以抵抗魚藤酮對多巴胺能細胞的損傷，但具體機制不清。腺相關病毒(AAV)對非分裂細胞有高感染效率且表達穩定，所以本實驗應用攜帶DJ-1基因的AAV顆粒感染大鼠模型。

圖3 DJ-1能明顯上調大鼠黑質自噬水平Fig.3 DJ－1 could enhance autophagy levels in SN of rats

圖4 DJ-1對自噬通路PI3K/mTOR通路的影響Fig.4 The effects of DJ－1 on autophagic signalling pathway－PI3K/mTOR

PD病理特征為中腦黑質多巴胺能神經元選擇性、進行性丟失。作為多巴胺合成的限速酶，酪氨酸羥化酶(TH)則廣泛表達在黑質多巴胺能神經元中。本研究應用免疫熒光染色方法進一步驗證外源性DJ-1是否在多巴胺能神經元中，即TH陽性神經元中高表達并發揮保護作用。結果發現外源性DJ-1(綠色)可同時表達在神經元中及其他膠質細胞中。但是，約60%的外源性DJ-1表達在TH陽性神經元中。

魚藤酮具有極強的親脂性，在不依賴多巴胺轉運體的情況下自由通過血腦脊液屏障和細胞膜并聚集在亞細胞器如線粒體內。本實驗利用魚藤酮建立PD大鼠模型，免疫組化結果顯示，在魚藤酮損傷4周后，與假手術組(Sham)相比，單純魚藤酮注射組(Ro)大鼠黑質TH+神經元降低顯著;而過表達外源性DJ-1后，可顯著緩解魚藤酮所致DA能神經元丟失。以上結果提示，DJ-1過表達對魚藤酮引起的大鼠多巴胺能神經元的損傷有抵抗作用，延緩多巴胺能神經元的退行性變。

自噬作用在細胞分化、增生、生存、死亡及對環境應激的應答方面極為關鍵，對防止某些疾病如腫瘤、肌病、神經變性疾病以及對抵御病原微生物的感染和延緩衰老、延長壽命等方面發揮重要作用［11］。它是廣泛存在于真核細胞內的一種溶酶體依賴性的降解途徑，可以吞噬無用的生物大分子和衰老的細胞器為新的細胞結構的構建提供能量和原料并可以通過清除聚集蛋白和受損細胞器起到保護作用。在自噬體形成過程中，LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)由胞質形式LC3-I(18 000)轉化為LC3-Ⅱ(16 000)形式并定位于自噬體雙層膜表面，參與自噬體代謝的全過程。因此LC3-Ⅱ成為自噬檢測的分子標記。研究［4］表明在SH-SY5Y細胞中應用自噬的誘導劑雷帕霉素可以減弱魚藤酮引起的線粒體功能失調，清除聚集的泛素化蛋白，最終減少細胞死亡數量。DJ-1可以影響包括蛋白酶體在內的蛋白清除途徑。干擾DJ-1后，能夠減弱百草枯誘導的自噬，增加SH-SY5Y細胞活力［2-3］。PI3K/mTOR通路是調控自噬發生的主要通路。mTOR是哺乳動物的雷帕霉素靶向蛋白，是自噬發生的啟動分子，對自噬起著負性調控作用。Beclin 1則通過形成3型PI3K復合體參與自噬的調節，Beclin的下游產物磷脂酰肌醇則是自噬體雙層膜結構延長所必需的原料。另有文獻［12-13］報道，在低氧時DJ-1可以影響Akt和mTOR的活性。以上文獻提示，DJ-1同自噬的發生有著密切的關系，那么自噬是否是DJ-1保護作用機制之一呢?蛋白免疫印跡實驗結果顯示DJ-1組黑質Beclin1蛋白表達增加以及LC3Ⅱ/Ⅰ的比值較假手術組及LacZ和NS組的比值增加1倍，另外3組之間差異無統計學意義。大鼠模型的結果證實在DJ-1起保護作用的同時有自噬現象的存在。根據已有的文獻和本研究的試驗結果，筆者推測在給予魚藤酮后，DJ-1激活影響mTOR/PI3K通路，上調Beclin1的表達，從而上調自噬水平，清除受損的線粒體發生線粒體自噬。

總之，本實驗發現無論在體水平的高低，DJ-1可以誘導自噬的發生，并且發揮保護性作用，這是對DJ-1具有保護性功能機制的一種新的發現和闡述，為PD的治療提供了一種新的思路和探索。

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