血管內皮生長因子及其受體表達水平下調增加垂體腺瘤卒中風險

賈 旺 劉 曉 魯潤春 賈桂軍 倪 明 孫 靜 徐志卿

(1.首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科，北京 100050;2.首都醫科大學基礎醫學院病理學系，北京 100069;3.首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系，北京 100069)

垂體腺瘤是顱內常見的良性腫瘤，在顱內腫瘤的發生率中僅次于膠質瘤和腦膜瘤，占顱內腫瘤總數的15%［1］。垂體腺瘤的生長過程中部分病例會出現腫瘤內出血，稱作腫瘤卒中。垂體腺瘤卒中發生的時間和程度差異很大，輕微者沒有臨床癥狀，嚴重者可以造成患者迅速失明。卒中的發生與腫瘤的血管生成能力關系密切。血管內皮生長因子(vascu-lar endothelial growth factor，VEGF)通過其受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)發揮血管生成作用，可能與垂體瘤卒中的生物學行為有關。本研究通過定量PCR檢測垂體腺瘤中最普遍的促血管生成VEGF剪接變體VEGF165及其受體的表達水平，以探討VEGF及其受體與垂體腺瘤卒中發生之間的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

標本取自2011年3月至2012年12月首都醫科大學附屬北京天壇醫院術后病理證實為垂體腺瘤的患者，總共166例，標本取自腫瘤接近中心部位，每份標本質量約為5 g。回顧了完整的病史、術前內分泌化驗，磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)影像資料則用來評估腫瘤大小、囊變、出血。腫瘤大小依靠MRI增強像上腫瘤的最大直徑判斷;腫瘤囊變定義為T1WI(T1 weighted image)低或等信號，T2WI(T2 weighted image)高信號;腫瘤出血定義為T1WI等信號，T2WI低信號或T1WI高信號，T2WI低或高信號;(圖1)。

圖1 MRI顯示垂體腺瘤卒中及囊變Fig.1 MRI images of intratumor hemorrhage and cystic lesions of pituitary adenomas

1.2 標本收集并反轉錄為cDNA

手術切除腫瘤組織后立即置入液氮中保存。按照RNeasy Lipid Tissue Mini Kit試劑盒流程提取RNA，－80℃保存。SuperscriptⅢ First－Strand Synthesis System for RT－PCR試劑盒流程將RNA反轉錄為cDNA，－20℃保存。

1.3 Real-time PCR

QPCR反應體系(SYBGreen):采用SYBR Green法，試劑為SYBR Green mixture(美國ABI公司)。每個反應體系 ddH2O 8 μL 、Primer F 0.5 μL、Primer R 0.5 μL、cDNA 1 μL 、SYBGreen 10 μL，總共 20 μL，每個樣本重復3次。循環條件:50℃ 2 min，95℃ 8 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40 個循環，40℃ 30 s。采用Roche LightCycler?480Ⅱ系統的分析功能，把GAPDH設定為內參，得出RQ值反應mRNA相對表達量。引物序列詳見表1。

表1 QPCR引物序列Tab.1 Primers used in the present study

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。本文主要指標為計量資料，先進行正態性檢驗，符合正態性條件時，采用t檢驗或方差分析;不符合正態性條件時，采用非參數檢驗;對VEGF及其受體的RQ值行正態性檢驗(P＜0.10)，均不符合正態分布。計量數據采用中位數和四分位數間距［M(P25，P75)］表示，組間行非參數檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 VEGF及其受體表達與患者年齡、性別的關系

本組入選病例166例，平均年齡45.4(19～74)歲;＜45歲者79例(47.6%)，≥45歲者87例(52.4%)，組間VEGF及其受體表達差異均無統計學意義。男性83例(50.0%)，女性83例(50.0%)，組間VEGF及其受體表達差異均無統計學意義，詳見表2。

2.2 VEGF及其受體表達與腫瘤大小的關系

腫瘤最大直徑1～2cm的小腺瘤組30例(18.1%)，2～3 cm的大腺瘤組66例(39.7%)，大于3cm的巨大腺瘤組70例(42.2%)，組間VEGF及其受體表達差異均無統計學意義，詳見表3。

2.3 VEGF及其受體表達與腫瘤內部囊變的關系

腫瘤磁共振檢查未見囊變組86例(51.8%)，灶狀囊變組 42例(25.3%)，顯著囊變組 38例(22.9%)，組間VEGF及其受體表達差異均無統計學意義，詳見表3。

表2 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3表達水平與年齡和性別的關系Tab.2 Age and gender of the patients and expression levels of VEGF，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3

表3 VEGF、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3表達水平與臨床表現信息表Tab.3 Clinical information of the patients and expression levels of VEGF，VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3

2.4 VEGF及其受體表達與腫瘤卒中的關系

腫瘤影像學檢查及術中證實腫瘤內無出血組132例(79.5%)，出血組34例(20.5%)，組間VEGF及其受體表達差異均無統計學意義。在96例無功能腺瘤組，無出血組77例(80.2%)，出血組19例(19.8%)，VEGF、VEGFR-3的表達差異有統計學意義(P=0.047，P=0.026)，VEGFR-1的表達接近有意義的結果，而VEGFR-2的表達差異均無統計學意義，詳見表3。

3 討論

垂體腺瘤內部的出血稱為垂體腺瘤卒中，發生率為1.5% 到27.7%，是其他顱內腫瘤的5.4倍［2-3］。垂體腺瘤內部的出血也可以不出現癥狀或癥狀輕微，僅在常規行CT或MRI檢查時發現，稱之為亞臨床卒中，在垂體巨大腺瘤中發生率約為14%～22%，明顯高于小腫瘤［4-5］。腫瘤內部迅速而大量的出血稱為垂體腺瘤急性卒中，可以引起腫瘤體積短時間內快速增長，壓迫視交叉并刺激鞍區附近的硬腦膜，造成患者出現突然而劇烈的頭痛、視力障礙、眼肌麻痹，是垂體腺瘤嚴重的合并癥。垂體腺瘤急性卒中的流行病學發生率約為5%，而術中證實卒中發生率約為2%［6］。

垂體腺瘤卒中在垂體腺瘤的生長過程中出現時間早晚和出血量差異很大，部分腫瘤體積較小卻出現了比較明顯的卒中，而有些腫瘤體積很大卻不出現腫瘤內部的出血，或者僅僅出現灶狀出血。臨床中還可以觀察到少數病例出現腫瘤比較完全的卒中后腫瘤消失。垂體腺瘤卒中出現生物學行為差異的原因尚未明確。

腫瘤內部的出血與新生血管的生成和腫瘤的生長狀態有關，垂體腺瘤也不例外。目前已經發現的血管生成因子中VEGF被認為是最重要的一種［7-8］。對于VEGF在腫瘤中的作用，既往研究［9-12］對于VEGF與垂體腺瘤的腫瘤內出血、囊變、腫瘤侵襲及內分泌分型等方面存在著不同的意見。VEGF受體的功能也是研究的熱點，VEGFR-1在正常垂體組織的內分泌細胞及垂體腺瘤上皮細胞表達，在MtT-S細胞系中發現，VEGF通過VEGFR-1促進腫瘤細胞的增生;VEGFR-2表達于血管內皮細胞，與腫瘤血管生成密切相關，且認為VEGF對正常垂體內血管完整性及通透性的調節有重要作用，通過其受體VEGFR-2及neuropilin-1 NRP-1 協同完成［13］。既往研究［14-16］顯示，垂體腺瘤的血管化程度較正常垂體組織差，臨床中腫瘤生長亦較緩慢，但垂體腺瘤組織中受體 VEGFR-1及VEGFR-2的表達相比正常垂體組織卻明顯增高［13，17-18］。

Arita等［9］(2004)報道垂體腺瘤中VEGF的過度表達引起血管通透性增加，促進水分滲出及囊腫形成，導致腺瘤內部壓力增加，而垂體腺瘤血液的供應部分來自于垂體門脈系統，即使輕微的壓力增加亦可部分阻斷腫瘤的血流灌注，繼而引起腫瘤的壞死出血，之后的一些研究［9，16，19-21］得出了類似的結論，但也有一些報道否認它們之間存在聯系，如Kong等［22］檢測了垂體腺瘤外周血中VEGF的表達，亦沒有得到有意義的結果。Jin Kim等［23］用RT-PCR技術檢測88例垂體腺瘤標本的VEGF表達水平，發現VEGF表達水平增高與垂體腺瘤卒中相關，并認為通過檢測其表達可以預測垂體腺瘤卒中的發生。

本研究總共166例標本，其中無出血組132例(79.5%)，出血組 34例(20.5%)。兩組間比較VEGF及其受體的表達差異均無統計學意義，進一步按照內分泌功能分組后，卻發現了有意義的結果。在本組研究中，無功能腺瘤 96例，占全部病例的57.8%，其中無出血組77例(80.2%)，出血組19例(19.8%)，出血比例與全組差異無統計學意義，但VEGF及其受體VEGFR-3的表達在腫瘤卒中病例中明顯降低，差異有統計學意義，VEGF-1的表達雖差異無統計學意義，但表達水平明顯降低，而VEGFR-2則無明顯變化。由于腫瘤內部的囊變也與腫瘤內部的血管通透性變化及出血后的吸收機化有關，尤其是具有快速視力下降和劇烈頭痛病史沒有及時就醫，而磁共振檢查顯示腫瘤內部有明顯囊變的病例，本研究認為也是腫瘤卒中的自然轉歸。本組腫瘤囊性變的病例分組差異未見統計學意義也與卒中組的統計分析一致。

無功能腺瘤在垂體腺瘤中最常見，因而最具有代表性。在垂體腺瘤中，血管的完整性及通透功能需要正常水平VEGF維持［9，13］，在VEGF表達水平下降時，血管正常功能受到影響，引起血管破裂出血，而受體VEGFR-1及VEGFR-3的表達明顯下降表明出血后腫瘤的增生能力降低。與血管生成相關的受體VEGFR-2的表達水平未見明顯變化也從反面證實腫瘤的卒中出血不是由于內部的新生血管過度增生引起，這一點作為良性腫瘤的垂體腺瘤與其他高度惡性的腫瘤卒中出血的機制可能有所不同。因此，本研究認為無功能腺瘤卒中的原因與VEGF表達水平顯著下調，血管不能維持其正常功能有關。

與既往的研究［12，24-27］相比，本研究病例數充足，分組統計詳盡，同時對VEGF及3個受體亞型進行檢測，特別是運用實時定量PCR進行檢測，克服了既往定性或半定量研究手段的缺點，結果可信度更高。本研究證實無功能垂體腺瘤的VEGF及VEGFR-3的表達下降與腫瘤卒中有關，但其上游調節機制和血管內皮細胞內對調控的反應還有待將來進一步研究。

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