基于ITS序列對萬壽菊葉斑病病原菌的分子鑒定

高山　王孟飛等

摘要：采用改良的CTAB法提取萬壽菊（Tagetes erecta L.）葉斑病病原菌總DNA，以ITS1和ITS4為引物擴增病原菌的ITS片段，PCR擴增產物純化后測序并與數據庫中的已知序列進行BLAST比對，構建分子系統發育樹，對該病原菌進行分子鑒定。結果顯示分離的萬壽菊葉斑病病原菌ITS序列與GenBank中萬壽菊鏈格孢（Alternaria tagetica）AF267134的ITS序列相似度為99%，在分子系統發育樹上與萬壽菊鏈格孢菌株聚為一支，結合形態特征確定分離的萬壽菊葉斑病病原菌為萬壽菊鏈格孢。

關鍵詞：萬壽菊（Tagetes erecta L.）；葉斑病；ITS；鏈格孢屬（Alternaria）；鑒定

中圖分類號：Q939；S432.4+2；S436.8；S682.1+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2074-03

萬壽菊（Tagetes erecta L.）為菊科（Compusitae）萬壽菊屬（Tagetes）一年生草本植物，不僅可用于城市的園林美化，同時也是理想的提純天然黃色素的原料。湖北省恩施土家族苗族自治州為發展當地經濟、加速新農村建設進程，積極建設萬壽菊種植基地，努力擴大種植面積，巴東、鶴峰、咸豐、來鳳等地的萬壽菊種植已形成一定規模。但萬壽菊易受到葉斑病的危害，發病率輕時占20%～30%，重則達70%以上，而且危害周期長、影響范圍廣，難以防治，使萬壽菊的產量和質量嚴重下降[1]，對萬壽菊的規模化生產造成了嚴重的威脅。

目前對萬壽菊葉斑病原菌的鑒定多采用傳統分類鑒定方法，因形態、地域的差異，結論并不一致。如高潔等[1]通過形態學、生理生化性狀及生態學特征將萬壽菊細菌性葉斑病的致病菌確定為丁香假單胞菌萬壽菊致病變種（Pseudomonas syringae pv. tagetis）；王龍等[2]則將甘肅地區萬壽菊葉斑病的病原鑒定為鏈格孢屬（Alternaria sp.）物種。王婷等[3]通過形態鑒定將萬壽菊葉斑病的病原菌鑒定為細極鏈格孢（A. tenuissima）。與傳統的形態學鑒定方法相比，分子標記技術快速穩定，且不易受環境等因素的影響。ITS序列是核糖體DNA上的轉錄單位間隔區（Internal transcribed spacer，ITS），進化中由于不加入成熟核糖體，承受的選擇壓力較小，進化相對迅速且具有廣泛的序列多態性，在其保守性上表現為在種內不同菌株間高度保守，而在種間存在明顯差異，這為真菌的分類鑒定和分子檢測提供了豐富的遺傳信息，有利于屬內種間或種內差異較明顯的菌群間的系統發育關系分析[4]。本研究采用ITS分子標記結合形態學分類法對萬壽菊葉斑病進行鑒定，以期為萬壽菊葉斑病的有效防治提供依據。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

萬壽菊葉斑病帶病植株采自湖北省恩施土家族苗族自治州巴東縣；病原菌菌株分離后保存于恩施職業技術學院生物工程系微生物實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 萬壽菊葉斑病病原菌總DNA的提取及檢測 采用改良的CTAB法[5]提取萬壽菊葉斑病病原菌的DNA，0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA樣品的質量。

1.2.3 萬壽菊葉斑病病原菌ITS序列測定 萬壽菊葉斑病病原菌ITS-PCR擴增產物采用UNIQ-10柱式PCR產物回收試劑盒純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司武漢測序部測序，測序要求為單向、正向測序，2個重復。

1.2.4 萬壽菊葉斑病病原菌ITS序列分析與分子系統樹的構建 將測序結果結合Chromas軟件查看峰形進行糾錯，所得序列在GenBank中進行BLAST同源性比對，同時在NCBI中下載同源序列。根據我國菊科植物上發現的鏈格孢屬物種[6]以及與鏈格孢屬形態相似的屬[7]選擇下載序列，共下載ITS序列16條。所有序列采用ClustalX 1.83軟件進行多序列比對，應用MEGA 4.0軟件采用鄰接法（N-J法）構建系統發育樹，其他參數默認，以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為外類群。

2 結果與分析

2.1 萬壽菊葉斑病病原菌ITS-PCR擴增產物的電泳檢測結果

結合形態觀察，萬壽菊葉斑病病原菌菌株培養后可產生分生孢子，呈倒棒狀、具長喙，孢子基本呈鏈狀分布，患病植株葉片上的病斑開始時近圓形或長圓形，褐色，直徑為1～5 mm，后變深褐色至近黑色，常相互愈合致整葉枯死，亦為害小枝和花莖，使病株矮化，或侵染花部使整朵花變黑褐色，與萬壽菊鏈格孢的形態學特征一致，從而可確定本研究分離的萬壽菊葉斑病病原菌為萬壽菊鏈格孢。

3 小結與討論

植物病原菌種類繁多，形態復雜且易受環境的影響，對這些病原菌的鑒定如果僅從形態學和生理生化特征來進行，有一定的局限性。分子鑒定具有快速、簡便、分辨率高等特點，并可進行多相分類，按照種系進化的關系確定精確的位置和定種，可使分類鑒定結果更加客觀合理[10]。基于ITS序列的分子標記技術靈敏、快速、準確[11，12]。本研究通過ITS序列分子鑒定，結合形態觀察確定分離的萬壽菊葉斑病病原菌為萬壽菊鏈格孢，為萬壽菊葉斑病的綜合防治和萬壽菊種植業的發展提供了科學依據。

參考文獻：

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