大鼠UQCRFS1基因的克隆及其表達模式分析

張婷　黃青松　范雪暉

摘要：通過克隆獲得泛醌-細胞色素C還原酶鐵硫蛋白亞基1（Ubiquinol-cytochrome C reductase iron-sulfur subunit 1，UQCRFS1）基因，對基因序列及其編碼的蛋白質進行分析，研究了其在大鼠（Rattus norvegicus）心、腦、腎、肺組織中的表達模式。測序結果顯示UQCRFS1基因全長826 bp，RT-PCR結果顯示其在大鼠心臟中表達量較高，腦和肺中表達量稍低，腎臟組織中表達量最低，推測UQCRFS1的功能可能與大鼠的心臟發育有關。

關鍵詞：大鼠（Rattus norvegicus）；UQCRFS1基因；克隆；表達模式

中圖分類號：Q786 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2174-03

鐵硫蛋白作為電子載體在生命活動中起著重要的作用，其特征是存在著鐵硫簇，常見的鐵硫簇中含2、3或4個鐵原子，這些鐵原子與多肽鏈相連，并由無機硫進行聯結，由簡單的鐵硫簇通過金屬聯結組裝成更復雜的結構[1-4]，鐵硫蛋白正是基于鐵硫簇而具有優異的電子傳遞功能。主要的鐵硫蛋白包括細菌和線粒體呼吸鏈中的復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，光合作用中的光系統Ⅰ和鐵氧還原蛋白，氮養菌中的固氮酶，Krebs循環中的順烏頭酸酶，以及哺乳動物中對鐵的吸收起調控作用的鐵調控蛋白Ⅰ等[5，6]。參與鐵硫簇合成的關鍵蛋白已經被確定，但對其分子水平上的機制及如何進行相互作用在機體內外合成鐵硫蛋白尚待進一步研究[7-9]。泛醌-細胞色素C還原酶鐵硫蛋白亞基1（Ubiquinol-cytochrome C reductase iron-sulfur subunit 1，UQCRFS1）是線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ中的一個亞單位，廣泛分布在生物體中。目前對UQCRFS1基因的研究主要集中于阿爾茨海默病、心肌收縮疾病、亨廷頓舞蹈病、帕金森等相關疾病上。本研究根據前期工作所得的差異性片段，進行生物信息學分析后設計出特異性引物，克隆出大鼠（Rattus norvegicus）UQCRFS1基因的全長，進而研究該基因在大鼠心、腦、肺、腎發育過程中的表達動態，為探討其在大鼠發育過程中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康SD純系大鼠，雌雄不限，購自新鄉醫學院實驗動物中心。分別取1日齡、10日齡、20日齡健康SD大鼠的心、腦、肺、腎組織用作基因表達譜分析。Taq DNA聚合酶、pGEM-T Easy載體和DNA回收試劑盒均購自TaKaRa公司，反轉錄試劑盒購自Fermentas公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

2 結果與分析

2.1 UQCRFS1基因的克隆

2.1.2 UQCRFS1基因的序列測定結果 采用DNA回收試劑盒回收并純化擴增得到的UQCRFS1基因，連接pGEM-T Easy載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性菌落提取質粒，對UQCRFS1基因測序，所得結果見圖2。UQCRFS1基因全長826 bp，編碼274個氨基酸。

2.2 UQCRFS1基因的表達模式分析

3 小結與討論

不同結構的鐵硫蛋白具有不同的生物學功能，主要包括參與電子傳遞、底物的結合與激活、鐵/硫的存儲、基因表達的調控、酶活力的調控等[10，11]。本研究克隆得到UQCRFS1基因，并根據測序結果得到其編碼的氨基酸序列，利用相關的預測軟件對該蛋白進行了結構和理化性質方面的分析。結果顯示，UQCRFS1含有274個氨基酸殘基，推測其分子式為C1306H2088N366O390S9，不穩定指數為46.87，表明其三維結構不穩定。預測UQCRFS1在哺乳動物網織紅細胞中的半衰期為30 h，在酵母中的半衰期為20 h以上，在大腸桿菌中的半衰期為10 h以上。

對UQCRFS1基因在大鼠心、腦、肺、腎各組織中的表達模式進行分析，結果表明該基因在心臟組織中表達量較高，腦和肺組織中表達量稍低，腎臟組織中表達量最低，同時發現該基因的表達水平隨組織的發育有上升趨勢。可見UQCRFS1與大鼠心臟發育有關，但其在大鼠發育過程中的作用機制還不清楚，有待進一步的研究。

參考文獻：

[1] REES D C. Great metalloclusters in enzymology[J]. Annual Review of Biochemistry， 2002，71（1）：221-246.

[2] FU W， JACK R F， MORGAN T V， et al. niFu gene product from Azotobacter vinelandii is a homodimer that contains two identical[2Fe-2S] clusters[J]. Biochemistry，1994，33（45）：13455-13463.

[3] BEINERT H. Iron-sulfur proteins： Ancient structures， still full of surprises[J]. Journal of Biological Inorganic Chemistry，2000，5（1）：2-15.

[4] BEINERT H， HOLM R H， M NCK E. Iron-sulfur clusters： Nature's modular， multipurpose structures[J]. Science，1997， 277（5326）：653-659.

[5] BALK J， LOBR AUX S. Biogenesis of iron-sulfur proteins in plants[J]. Trends in Plant Science， 2005，10（7）： 324-331.

[6] LILL R， M HLENHOFF U. Iron-sulfur-protein biogenesis in eukaryotes[J]. Trends in Biochemical Sciences，2005，30（3）：133-141.

[7] EMAHAZION T， BESKOW A， GYLLENSTEN U， et al. Intron based radiation hybrid mapping of 15 complex I genes of the human electron transport chain[J]. Cytogenetic and Genome Research， 1998，82（1-2）：115-119.

[8] 侯萬儒，陳 瑜，彭正松，等. 大熊貓輔酶Q-細胞色素C氧化還原酶的輔酶Q連接蛋白基因cDNA的克隆及序列比較[J]. 獸類學報，2007，27（2）：190-194.

[9] 王祖秀，郝彥哲，侯萬儒.大熊貓NADH-輔酶Q氧化還原酶鐵硫蛋白亞基6基因（NDUFS6）的序列分析[J].獸類學報，2008， 28（3）：321-324.

[10] DAI S D， SCHWENDTMAYER C， SCH？譈RMANN P， et al. Redox signaling in chloroplasts： Cleavage of disulfides by an iron-sulfur cluster[J]. Science，2000，287（5453）：655-658.

[11] 孫 飛，周強軍，孫 吉，等.線粒體呼吸鏈膜蛋白復合體的結構[J].生命科學，2008，20（4）：566-578.