ADSC—bFGF對大鼠背部帶蒂皮瓣存活率的實驗研究

劉丹等

[摘要]目的：脂肪來源間充質干細胞復合堿性成纖維細胞生長因子（ADSC-bFGF）對大鼠背部帶蒂皮瓣模型存活率的影響。方法：獲得SD大鼠腹股溝脂肪，經體外分離、培養并進行多功能分化潛能的鑒定。MTT法檢測bFGF培養液對ADSC的影響。建立大鼠背部自身對照帶蒂皮瓣模型。應用CM-DiI熒光染料標記ADSC。在皮瓣可預測壞死區域分別給予A1組bFGF、A2組ADSC、A3組bFGF-ADSC、B組生理鹽水。全部動物于術后7天測量皮瓣成活面積、HE染色、冰凍切片的CD31熒光顯影，統計學分析ADSC-bFGF促進皮瓣成活的作用。結果：bFGF有明顯促ADSC增殖作用，增值最快的最低濃度為5μg/L。A3組皮瓣成活率、毛細血管增生均顯著高于其它組。結論：bFGF可促ADSC增值，具有協同作用。ADSC-bFGF可高效的刺激大鼠背部自身對照帶蒂皮瓣的血管新生，顯著的提高皮瓣的成活率。

[關鍵詞]脂肪來源間充質干細胞；堿性成纖維細胞生長因子；大鼠背部帶蒂皮瓣

[中圖分類號]R622 R332 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）08-0829-04

提高皮瓣的成活率，促進皮膚創傷修復是目前臨床工作需要解決的關鍵問題，因此研究尋求有效的方法預防術后皮瓣的缺血壞死具有重要的理論和臨床實際意義。使用各種不同的動物皮瓣模型往往會導致難以解釋的實驗結果。本研究采用可預測皮瓣壞死面積的帶蒂皮瓣模型，并改進形成自身對照皮瓣。目的是通過使用ADSC-bFGF局部注射，刺激大鼠實驗組皮瓣模型的血管新生，從而增加皮瓣的成活率。

1 材料

1.1 設計：采取隨機，對照，動物實驗。

1.2 實驗材料：健康純種雄性SD大鼠，質量為400～500g，21只，250～280g，10只。（哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供）。DMEM-F12培養基、胎牛血清（美國Sigma公司），油紅O（美國Sigma公司）；2%茜紅素染液（美國Sigma公司），噻唑藍（MTT）檢測試劑盒（ 武漢博士德） ，二甲基亞砜（美國Sigma公司），CM-DiI（美國Molecular Probe公司），小鼠抗大鼠CD31抗體美國Abcam公司）；貝復濟（珠海億勝生物制藥有限公司）山羊抗小鼠IgG-FITC（中杉金橋）；酶標儀（日本Reader儀器公司）

2 方法

2.1 脂肪來源間充質干細胞 （Adipose derived stromal cell，ADSC）的體外分離、純化、擴增培養：取250～280g雄性SD大鼠，無菌條件下采集雙側腹股溝脂肪，0.1%Ⅰ型膠原酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM-F12終止，離心重懸，以3×104個/cm2接種于25cm2塑料培養瓶，置于 37℃，5% C02的孵箱內培養，72h換液，棄掉未貼壁細胞，每3天換液1次。通過多次傳代獲取純化的ADSC。

2.2 ADSC分化能力的鑒定：向培養ADSC的6孔板加入成骨、成脂誘導液，4周后進行茜素紅染色、油紅O染色檢測。

2.3 bFGF對ADSC增值影響：取第5代ADSC接種于96孔板，細胞貼壁后每孔按0、2.5、5、10、50、100μg/L濃度加入bFGF培養液200μl，每個濃度3孔；48h后檢測，加5 g/L的MTT 溶液20μl，37℃孵育4 h，棄孔內液體，再加二甲基亞砜150μl低速震蕩10min，用酶聯免疫檢測儀測A490值，并記錄結果。重復3次實驗。

2.4 DiI熒光標記ADSC：注射細胞之前，取第5代細胞用無血清培養液制成2×106/ml的細胞懸液1ml，加2μg/ml DiI染液，37℃孵育30min，離心重懸后，傾去染液，加PBS溶液制成1ml細胞懸液，孵箱孵育5min后移入4℃冰箱備用。

2.5 實驗分組及治療：實驗動物21只，每只分為左側實驗組A組（隨機分成A1、2A、A3）、右側對照組B組。A 1組：注射bFGF；A2組：注射ADSC；A3組：注射ADSC+ bFGF；B組：注射生理鹽水。

2.6 大鼠背部自身對照帶蒂皮瓣模型的建立：健康純種雄性SD大鼠，400～500g，水合氯醛（10%）腹腔注射麻醉（3ml/kg），自身對照皮瓣模型設計成兩個等大矩形，大小3cm×8cm。消毒鋪巾，沿設計切口線切開皮膚至深筋膜層，沿頭尾方向掀起皮瓣，離斷全部穿支血管，僅保留兩側旋髂深動脈為蒂，徹底止血。取經標記的ADSC，對A1、A2、A3、B組分別注射bFGF、ADSC、ADSC-bFGF懸液、生理鹽水，注射范圍是皮瓣頭側上1/3，每點均為0.1ml，總量為1ml/只，原位縫合切口。術后7天觀察皮瓣 （圖1）。

2.7 皮瓣壞死的鑒定：術后7天，處死動物，數碼相機進行拍照，使用Image pro-Plus6.0軟件評估皮瓣成活與壞死面積。通過公式R=皮瓣存活面積/皮瓣總面積×100%計算皮瓣成活率。

2.9 組織學觀察：切取各組成活皮瓣遠端，制成石蠟病理切片HE染色，鏡下觀察血管增生情況。

2.10 ADSC及CD31在皮瓣中的檢測：切取A組注射細胞區域的皮瓣組織，快速制成冰凍切片，用免疫熒光染色法對血管內皮細胞特異性標志物CD31進行檢測，判定微血管密度和皮瓣中細胞情況。

2.11應用SPSS 17.0 軟件進行統計學分析，各組數據用x±s表示，組間比較用t檢驗，P<0.05，有統計學意義。

3 結果

3.1體外ADSC的培養與鑒定：ADSC原代培養2周，可達90%融合，平行排列呈漩渦狀，形態以長梭形為主，可進行傳代。取第3代細胞，經成骨誘導4周可見茜素紅染色致密、不透光的鈣化結節，呈淡紅色；經成脂誘導油紅O染色可見大小不等成圓性橙紅色的脂肪滴；證明誘導成功。

3.2 MTT檢測bFGF對ADSC增值作用：在本研究的劑量范圍內，不同濃度bFGF對ADSC的增值均有促進作用（P<0.05）。5ng/ml組與2.5mg/ml組組相比，差異有明顯統計學意義（P<0.01）；5ng/ml組與10ng/ml組、50ng/ml組、100ng/ml組組相比，差異無統計學意義（P>0.05）。因此， 促進ADSC增殖最快的最低濃度是5ng/ml（表1）。

3.4皮瓣大體觀察及成活情況：術后1周，觀察大鼠背部皮瓣，其成活區和壞死區分界明顯，易辨別。圖片經圖像分析系統計算出 A1、A2、A3、B組皮瓣成活率分別是（86.01±1.71）%、（91.73±2.23）%、（95.12±2.01）%、（70.68±1.82）%。統計學各組分析比較，A3組皮瓣存活率明顯高于A1、A2、B組（P<0.01），A1組成活率高于A2組（P<0.01）（表2，圖2）。

3.5 HE 染色分析：HE染色可見，A3比A1、A2組皮瓣的新生毛細血管分布明顯增多，纖維組織細胞增生明顯，B組新生血管較少。

3.6 ADSC在皮瓣內的分布與檢測：熒光顯微鏡下觀察可見，經CM-DiI染色呈陽性的ADSC為紅色熒光、CD31呈陽性為綠色熒光，且紅色熒光的ADSC在綠色熒光的內皮細胞之間，參與構成了毛細血管的管腔結構。（圖3）

4 討論

可預測皮瓣壞死面積的軸型皮瓣模型[1]，平均成活比例為（70.5±4.8）%，這種可預測性對研究皮瓣的病理生理學有重要意義，本實驗在此基礎上建立自身對照的帶蒂皮瓣，使個體差異性減小且對比性更強。提高皮瓣的成活率，增加血液循環及血管再生是關鍵。

bFGF是一種多功能細胞生長因子，是血管內皮細胞、血管平滑肌細胞與成纖維細胞的高效促生長劑，能夠有效的促進新生毛細血管的形成[2-3]，從而促進皮瓣成活。劉斌[4]等證實應用bFGF可促進新生微血管的數量增加，從而增加大鼠背部隨意皮瓣成活面積。本實驗也顯示A1組明顯高于B組的皮瓣成活面積。

2001年，Zuk等[5]成功從脂肪組織中分離培養出ADSC，因其具有與骨髓干細胞、胚胎干細胞一樣的多項分化潛能，取材方便，損傷小，且來源豐富，又不受倫理學約束，被認為可能會成為組織工程的理想種子細胞。由于ADSC在體外容易擴增，長期表達穩定，并且ADSC移植體內在自身存活基礎上，還可很大程度改善機體功能[6]。因此，在修復缺血皮瓣和組織工程方面起了重要作用。文獻報道ADSC能生成血管結構和抗凋亡因子，有影響血管再形成的潛力，也可分化成有功能的內皮細胞[7-9]。本研究結果顯示：成紅色熒光的ADSC分布在成綠色熒光的血管內皮細胞周圍，說明ADSC參與并促進了毛細血管管腔的構成。ADSC可以預防新生小鼠的缺血缺氧性腦病的發生，可增加兔任意型皮瓣的成活面積[10-11]，其主要原因可能與其具有分化生成內皮細胞，促進新生血管內皮細胞生長，增升血管密度，從而增加組織成活的作用有關。本研究中A2組皮瓣成活率明顯高于B組與A1，也證明了上述觀點，并且分別單獨使用ADSC比bfGF促皮瓣成活率效果好。

bFGF屬于多肽類細胞生長因子，對中胚層來源的細胞具有明顯的促增殖作用[12]。有研究表明，bFGF可以促進猴骨髓間充質干細胞和人羊膜間充質干細胞的增殖[13-14]。本文使用含不同濃度的bFGF培養液培養ADSC，經MTT檢測表明，bFGF促ADSC增值作用顯著，且5ng/ml是作用最快的最低濃度；同時，ADSC移植能促進腦缺血大鼠缺血區微血管的生成，ADSC-bFGF 能刺激大鼠腹部橫行腹直肌肌皮瓣的血管新生，增加皮瓣的存活率[15-16]。其機制可能是ADSC可促進bFGF的表達，bFGF又可促ADSC生長，二者相互協同，從而可顯著的促進皮瓣成活面積。

綜上所述，單一因素的bFGF、ADSC都能促進皮瓣成活，而且二者之間具有協同作用。本實驗使用ADSC-bFGF進行皮瓣局部注射，皮瓣成活率顯著高于單一使用bFGF和ADSC懸液組。說明bFGF可提高ADSC增值和皮瓣成活率的同時，后者也可促進前者的生成以及皮瓣成活。因此，多因素之間互相促進、生長，把ADSC和bFGF的優勢有機結合，能更強的促進缺血組織的血管新生，增加背部自身對照帶蒂皮瓣的成活面積。為ADSC-bFGF的臨床應用研究提供理論與實踐依據；特別是對整形外科中的皮膚組織修復具有重要意義。

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[收稿日期]2013-03-15 [修回日期]2013-04-16

編輯/張惠娟