莫諾苷對黑素瘤細胞與角質形成細胞共培養模型黑素合成的影響

于洪敏　陳景華

[摘要]目的：探討莫諾苷對黑素瘤細胞與角質形成細胞共培養模型黑素合成的影響。方法：將黑素瘤細胞（A375）與角質形成細胞（Hacat）以1：2比例建立共培養模型，以不同濃度莫諾苷進行干預，通過MTT法測定細胞增殖率；NaOH裂解法測定黑素含量；多巴氧化法測定酪氨酸酶活性。結果：與陰性對照組相比，10-4 mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫諾苷均對細胞增殖無影響（P>0.05），10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫諾苷均對共培養體系酪氨酸酶活性和黑素合成有極顯著差異（P<0.01）；與陽性對照藥熊果苷組相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫諾苷均對共培養體系酪氨酸酶活性和黑素合成有差異（P<0.05或P<0.01）。結論： 莫諾苷可能通過抑制酪氨酸酶活性來抑制共培養模型的黑素合成。

[關鍵詞]莫諾苷；黃褐斑；酪氨酸酶；黑素

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）08-0833-03

黃褐斑是一種獲得性色素沉著性皮膚病，給患者生理和心理都帶來很大影響。人體皮膚顏色各不相同，與種族、年齡、性別、外界環境以及某些疾病等因素密切相關，其中黑素細胞產生的黑素是決定皮膚顏色的主要因素[1]，酪氨酸酶是黑素生物合成途徑中的主要限速酶，該酶活性大小決定著黑素形成的數量。有研究表明，中藥山茱萸的水提取物對黑素合成和黑素合成關鍵酶酪氨酸酶有抑制作用，提示可能對黃褐斑等色素性疾病具有一定的應用開發前景[2] 。山茱萸是中醫治療黃褐斑方劑中常被采用的中藥，中醫認為山茱萸通過補腎的功效來治療黃褐斑[3]。莫諾苷是山茱萸的主要有效成分之一，本實驗研究莫諾苷對共培養模型黑素合成的影響及機制。

1 實驗材料

莫諾苷（購于上海融禾醫藥科技有限公司）；人黑素瘤細胞株（A375）（由中國科學院細胞中心提供）；人永生化角質形成細胞（Hacat）（購自武漢大學中國典型培養物保藏中心）；MEM培養基（購于Gibco公司）；胰蛋白酶、雙抗、胎牛血清（購于Billab公司）；二甲基亞砜、L-dopa、TritonX-100、熊果苷、甲基噻唑四唑（購于Sigma公司）。酶標儀（上海熱電儀器有限公司）；OLympus倒置顯微鏡（日本Olympus株式會社）；離心機（上海安亭科學儀器廠）；生物潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；超低溫冰箱（Thermo Electron Corporation）；CO2孵育箱（上海智成分析儀器制造有限公司）。

2 實驗方法

2.1 建立共培養模型：待兩瓶細胞均生長至對數期時，每個培養瓶中加入1mL25%的胰蛋白酶進行消化，然后分別加入MEM中止消化，1500rpm，離心3min。離心后將細胞重懸。計數板計數。按A375細胞數與Hacat細胞數比例為1∶2將兩種細胞懸液混合，接種到需要規格的培養板中。

2.2 細胞增殖率：將 A375 和 Hacat 以1∶2的比例制成細胞懸液，調整細胞密度為 1.5×104個/mL，接種在 96 孔板中，200μl/孔。37℃、5% CO2培養箱中培養24h，棄培養液，陰性組只加含細胞的培養液，陽性組加入3.67×10-3mol/L熊果苷，實驗組加入莫諾苷各濃度含藥培養液，每孔 200μl，每組設5個復孔，繼續培養48 h，在結束前4 h，每孔加20μl 5g/L MTT，繼續培養4h，棄原培養液，每孔加DMSO 150μl，振蕩10min，酶標儀在490nm處測吸光度（A），計算細胞增殖率。細胞增殖率=（A實驗組/A陰性對照組）× 100%。

2.3 黑素含量：本實驗黑素含量測定采用Hunt[4]法。將A375和Hacat以1：2的比例接種到六孔板中，細胞濃度為4.5×104個/ml， 每孔2ml，5%CO2，37℃培養箱中培養24h之后棄原培養液，陰性對照組加培養液2ml，陽性對照組3.67×10-3mol/L熊果苷2ml/孔，給藥組設3個復孔，每孔2ml，分別加入含不同濃度莫諾苷的培養液。5%CO2，37℃培養箱中培養48h。48h以后，棄原培養液，用PH7.4的0.01MPBS洗滌2次，然后加入0.25%胰酶1ml/孔消化大約10min后，加入1mlMEM培養液終止消化，制成細胞懸液，將不同組細胞懸液分別收集到15ml離心管中，1500rpm，離心3min，棄上清，加入100μl濃度為1mol/L NaOH，37℃水浴1h。加400μl雙蒸水釋稀，混勻，每只離心管中取100μl分別加入96孔板中，490nm測定各孔A值。黑素含量=[（A實驗組/細胞數的平均值）/（A陰性對照組/細胞數的平均值）]×100%。

2.4 酪氨酸酶活性：細胞內酪氨酸酶活性測定[5]采用多巴氧化法。將A375和Hacat以1：2的比例接種到96孔板中，將細胞濃度調整至1.5×104個/ml， 每孔200μl，5%CO2，37℃培養24h后棄原培養液，陰性對照組只加培養液200μl，陽性對照組加3.67×10-3mol/L熊果苷200μl，給藥組加入含不同濃度莫諾苷的培養液，每組設5個復孔，繼續培養48h， 用pH7.4的0.01M的PBS洗滌2次，每孔加1%Triton-X溶液100μl，迅速置-80℃冰箱30min，然后室溫下融化，充分裂解細胞。37℃預熱，加0.2%L-dopa溶液50μl/孔，37℃下反應3h，490nm波長測定A值。

2.5 統計學處理：使用SPSS 18.0 軟件進行統計學分析，所測數據以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，方差齊性用t檢驗，多組間比較采用 LSD 檢驗。

3 結果

3.1 莫諾苷對共培養模型細胞增殖的影響：結果見表1，與陰性組相比，10-4mol/L與10-7mol/L之間莫諾苷對共培養模型的抑制率在10%以下，適合進行下一步研究。

3.2 莫諾苷對共培養模型酪氨酸酶活性的影響：結果見表2，與陰性對照組相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L對共培養模型酪氨酸酶活性的抑制作用有顯著差異（P<0.01）。與陽性對照藥熊果苷組相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L對共培養模型酪氨酸的抑制作用有差異（P<0.05），抑制作用強于熊果苷。

3.3 莫諾苷對共培養模型黑素合成的影響：結果見表3，與陰性對照組相比，10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L對共培養模型黑素合成的抑制作用有顯著差異（P<0.01）。與陽性對照藥熊果苷組相比，10-5mol/L和10-6mol/L對共培養模型黑素合成的抑制作用有差異（P<0.05），10-7mol/L有顯著差異（P<0.01），抑制作用均強于熊果苷。

4 討論

黃褐斑病程較長，發展緩慢，以中青年女性多見，嚴重影響美觀，現已成為醫學和美容界共同面臨的難題 [6]。黃褐斑的發病原因，已經實驗證明的一點是由于黑色素增多形成的[7]。皮膚色素或黃褐斑與酪氨酸酶有密切關系。在酪氨酸酶的作用下，酪氨酸轉化為黑色素，從而加重皮膚色斑的形成[8]。黑素生成量與TYR活性相關，控制其活力即可控制黑素生成量[9]。黑素在表皮基底部的黑素細胞中形成。其過程為黑素細胞中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴、多巴醌最終形成黑素[10]。通過黑素細胞（MC）的體外純培養可以研究黃褐斑、白癜風、白發等色素障礙性疾病的發病機制，也可以利用黑素細胞模型來篩選治療這些疾病的藥物和方法[11]。黑素細胞與鄰近細胞間的相互作用不容忽視，故黑素細胞和角質形成細胞共培養提供了一種更好的檢測模型[12]。實驗表明莫諾苷對A375和Hacat共培養模型酪氨酸酶活性和黑素合成均有抑制作用，對共培養細胞增殖率無明顯影響，表明莫諾苷在不殺細胞濃度范圍內通過抑制酪氨酸酶活性來抑制黑素合成，而且抑制作用強于陽性對照藥熊果苷。莫諾苷的研究結果與預想一致，這對于開發治療黃褐斑的藥品或者化妝品有較大的應用前景。

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[收稿日期]2013-04-08 [修回日期]2013-04-18

編輯/張惠娟