生防細(xì)菌LN04抑菌譜檢測及其抗菌蛋白部分特性分析

郭康姣

摘 要： LN04是一株分離自鰻鱺養(yǎng)殖場排污口附近的芽孢桿菌（Bacillus sp.），其發(fā)酵上清液與淡水養(yǎng)殖主要病原菌進行拮抗試驗，結(jié)果表明，LN04對嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda）、星狀諾卡氏菌（Nocardia asteroides）和鰻弧菌 （Vibrio anguillarum）有很強的抑制作用。LN04的無菌發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀，沉淀物透析除鹽后所得的活性物質(zhì)粗提物初步鑒定為一種抗菌蛋白質(zhì)，該抗菌蛋白可耐受100 ℃的高溫，對酸的耐受性也比較強，但對部分蛋白酶敏感。LN04對部分淡水養(yǎng)殖病原菌的強抑菌作用和它的抗菌蛋白對環(huán)境條件的高穩(wěn)定性，表明該菌有可能作為一種生防細(xì)菌，開發(fā)應(yīng)用于淡水養(yǎng)殖中細(xì)菌病害的防治。

關(guān)鍵詞：生防細(xì)菌；抑菌譜；抗菌蛋白

中圖分類號：S432.4 文獻標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.004

細(xì)菌病是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的常見病害，慢性或急性發(fā)作都會造成養(yǎng)殖生產(chǎn)的重大損失[1]。目前施用抗生素是細(xì)菌病防治的主要手段，但應(yīng)用抗生素防治細(xì)菌病往往引發(fā)諸多嚴(yán)重問題，包括細(xì)菌耐藥性、藥殘及對養(yǎng)殖環(huán)境和流域因抗生素本底殘留而造成的污染等[2]。國內(nèi)外諸多研究和生產(chǎn)實踐表明，針對性地篩選病原菌的拮抗菌，通過以菌治菌，可有效尋找到解決細(xì)菌性疾病的新途徑[3-7]。本研究從鰻鱺養(yǎng)殖場排污口附近分離到一些水產(chǎn)常見致病菌的拮抗菌，其中菌株LN04對嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華菌、星狀諾卡氏菌和鰻弧菌有很強的抑制作用，筆者開展了該菌株的抗菌譜檢測試驗并對其抗菌蛋白的部分特性進行了分析，以期為該生防菌株的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

用于分離目標(biāo)菌株的樣品采自福建福清市某一鰻鱺養(yǎng)殖場，該養(yǎng)殖場經(jīng)常發(fā)生嚴(yán)重的鰻鱺細(xì)菌性病害。

1.2 拮抗菌的分離和富集

1.2.1 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g， 瓊脂20 g，NaCl 10 g，水1 000 mL。

富集培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，甘油10 mL，K2HPO4 1.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，水1 000 mL。

1.2.2 拮抗菌的分離、富集 先以梯度稀釋法對樣品進行若干梯度的稀釋，然后采用涂布平板法在裝有分離培養(yǎng)基的平板上進行各梯度稀釋液的涂布，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，挑取單菌落至裝有上述富集培養(yǎng)基的試管，置于臺式搖床中進行發(fā)酵（37 ℃，180 r·mim-1 ），32 h后下?lián)u床，通過離心或濾膜過濾的方法進行除菌，獲得上清液，然后檢測上清液是否有抑菌活性。

1.2.3 抑菌活性檢測 抑菌活性的檢測方法按照參考文獻[8]進行，指示菌為鰻弧菌 （Vibrio anguillarum），該菌來自于國家海洋局第三海洋研究所微生物實驗室。

1.2.4 拮抗菌的初步鑒定 應(yīng)用菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化試驗以及菌株的16S rDNA測序比對，進行拮抗菌的初步鑒定，其中16S rDNA測序委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 菌種發(fā)酵和抑菌譜檢測

1.3.1 菌種發(fā)酵 把篩選到的拮抗菌接種至裝有KB液體培養(yǎng)基的三角瓶中（接種量5%）進行發(fā)酵培養(yǎng)（37 ℃，200 r·min-1），發(fā)酵持續(xù)48 h，然后發(fā)酵液離心（8 000 r·mim-1， 10 min， 4 ℃）去菌體，所得上清液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抑菌譜測定 選擇鰻鱺養(yǎng)殖主要常見致病菌，包括嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda）、星狀諾卡氏菌（Nocardia asteroides）、鰻弧菌 （Vibrio anguillarum）、熒光假單胞菌 （Pseudomonas fluorescens）、溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）等作為抗菌譜檢測菌（這些檢測菌除鰻弧菌外均來自于福建師范大學(xué)教育部工業(yè)微生物重點實驗室），按1.2.3方法，進行目標(biāo)菌發(fā)酵上清液對這些病原菌的抑菌作用檢測，得出所選目標(biāo)菌（拮抗菌）的抑菌譜。

1.4 抗菌物質(zhì)類型的初步鑒定

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，把發(fā)酵液除菌后所得上清液用飽和度為70%的硫酸銨溶液沉淀，離心（10 000 r·mim-1， 10 min， 4 ℃）后得沉淀物和離心液，對沉淀物進行透析除鹽，并進行濃縮，得到抗菌物質(zhì)（即抗菌蛋白）粗提物，用無菌水復(fù)溶粗提物，以KB培養(yǎng)基為對照，用1.2.3的方法分別檢測該粗提物、離心液及上清液的抑菌活性并進行比較。

1.5 抗菌蛋白部分特性分析

抗菌蛋白的特性分析參考文獻[9]的試驗方案進行，主要考察抗菌蛋白粗提物在不同溫度、酸堿度及蛋白酶作用下，其抑菌活性所受影響和變化。

1.5.1 不同溫度對抗菌蛋白抑菌活性的影響 抗菌蛋白粗提物分別在50，70，90，100 ℃下處理30 min，另外以巴斯德蒸汽加壓消毒方式（121 ℃）處理20 min， 待溫度恢復(fù)至常溫后，對處理過的抗菌蛋白粗提物進行抑菌活性檢測，并與處理前（作為對照組）進行對比。

1.5.2 不同pH 值對抗菌蛋白抑菌活性的影響 依次用pH值為2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0的酸堿梯度在恒溫37 ℃下處理抗菌物質(zhì)30 min，而后再用弱酸弱堿把處理液調(diào)回原值，而后進行抑菌活性檢測，并與處理前（作為對照組）進行對比。

1.5.3 不同蛋白酶對抗菌蛋白抑菌活性的影響 選擇4種常見蛋白酶包括胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶以及胰蛋白酶分別與抗菌蛋白粗提物進行酶解反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)定為：酶濃度1 mg·mL-1，反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)時間60 min。酶解反應(yīng)完成之后，水浴加熱（100 ℃，15 min）使酶失活，然后進行抑菌活性檢測，并與處理前（作為對照組）進行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果及目標(biāo)菌的初步鑒定

從樣品中共篩選到對鰻弧菌有抑菌作用的候選菌11株，編號LN01～LN11，其中LN04抑菌作用最強。形態(tài)學(xué)的觀察顯示， LN04的菌落呈乳白色，表面有褶皺、細(xì)胞呈桿狀，菌內(nèi)有橢圓形芽孢。菌株的生理生化試驗結(jié)果為：G+，好養(yǎng)性生長，而葡萄糖發(fā)酵、檸檬酸鹽發(fā)酵、淀粉水解、明膠液化、V-P測定等反應(yīng)皆呈陽性，據(jù)此并參照伯杰[10]和東秀珠[11]的相關(guān)細(xì)菌鑒定方法， 以及比對所測得的16s rDNA 序列，初步鑒定所篩選、獲得的LN04為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

2.2 LN04的抑菌譜

在實驗室條件下，基于抑菌譜測定的LN04拮抗試驗結(jié)果如表1所示。

拮抗試驗結(jié)果表明，LN04對嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華菌、星狀諾卡氏菌和鰻弧菌 均有很強的抑制作用，其中對嗜水氣單胞菌的抑菌效果最好。

2.3 抗菌物質(zhì)類型的初步鑒定結(jié)果

利用離心、鹽析、透析對LN04發(fā)酵液進行處理，得到了粗提物，以KB培養(yǎng)基為對照， 按1.2.3的方法，在同一個抑菌板上進行離心液、發(fā)酵上清液、粗提物和對照組（從左到右依次排列）抑菌活性檢測試驗，結(jié)果如圖1。顯然，活性物質(zhì)為胞外分泌物，并且大部分集中在粗提物中，因為粗提物的抑菌圈明顯大于上清液的抑菌圈。由于硫酸銨對蛋白質(zhì)具有選擇性沉淀性質(zhì)，因此，LN04發(fā)酵過程中產(chǎn)生的胞外抑菌活性物質(zhì)可初步鑒定屬于蛋白類。

2.4 溫度對抗菌蛋白粗提物抑菌活性的影響

抗菌蛋白粗提物經(jīng)各溫度梯度處理一定時間后，按1.2.3的方法進行抑菌活性檢測，結(jié)果見如下表2。試驗結(jié)果表明，LN04的抗菌蛋白對熱穩(wěn)定，當(dāng)溫度超過100 ℃時，其抑菌活性僅降低15%。

2.5 pH 值對抗菌蛋白粗提物抑菌活性的影響

按設(shè)定的溫度梯度和時間對抗菌蛋白粗提物進行處理，然后按1.2.3的方法進行抑菌活性檢測，結(jié)果如表3所示。LN04的抗菌蛋白粗提物對酸堿度的適應(yīng)范圍較寬，在pH值范圍為4～10時，抑菌活性影響不是很大，但強酸和強堿對抑菌活性的破壞相當(dāng)明顯。

2.6 蛋白酶對抗菌蛋白粗提物抑菌活性的影響

所選擇的4種蛋白酶分別與抗菌蛋白粗提物酶解反應(yīng)后，馬上進行失活，然后按1.2.3的方法進行抑菌活性檢測，結(jié)果見表4。可以發(fā)現(xiàn)，LN04的抗菌蛋白對胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感，但對蛋白酶K和木瓜蛋白酶則具有較好的穩(wěn)定性。

3 討 論

鰻鱺養(yǎng)殖通常采用集約化模式，如室外水泥池高密度養(yǎng)殖、室內(nèi)玻璃纖維桶超高密度循環(huán)水養(yǎng)殖等。由于擁擠效應(yīng)和管理疏漏等原因，各種病害經(jīng)常發(fā)生，特別是細(xì)菌性病害如出血病、闌尾病、脫粘癥、腸炎等[12]。基于水產(chǎn)品安全考慮，抗生素用于水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性病害防治已受到越來越多的限制，人們開始探索生防細(xì)菌用于細(xì)菌病防治的可行性并取得良好的效果。芽孢桿菌是一類重要的生防細(xì)菌，其篩選及開發(fā)利用受到國內(nèi)外的極大重視，并已在生產(chǎn)上得到成功的應(yīng)用[13-14]。在本研究中，LN04篩選自鰻鱺養(yǎng)殖場的排污口，由于排污口特殊的生境，在長期的作用下，LN04具有了拮抗所在環(huán)境中某些病原菌的特殊功能， 表現(xiàn)為LN04在實驗室條件下對嗜水氣單胞菌具有強抑制作用，對遲緩愛德華菌、星狀諾卡氏菌和鰻弧菌也有很強的拮抗性能。

生防細(xì)菌的拮抗性能，有來自活菌本身的，也有來自其分泌的拮抗物質(zhì)如（抗菌蛋白），或兩者兼之。所分泌的活性物質(zhì)，有的分泌于胞內(nèi)，有的分泌于胞外。作為抗菌物質(zhì)，其應(yīng)用價值除了與其活性和抑菌范圍（抑菌譜）有關(guān)外，還與抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性有重要關(guān)系[15-16]。本研究結(jié)果顯示，LN04所分泌的胞外抗菌蛋白對環(huán)境條件的穩(wěn)定性良好，其中對高溫表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，對酸堿度的適應(yīng)范圍也較廣，對蛋白酶K和木瓜蛋白酶也不是很敏感，LN04的這些良好性能，包括較好的抑菌活性、較廣的抑菌譜、以及抗菌蛋白對環(huán)境條件較好的穩(wěn)定性，預(yù)示著該生防菌株有較好的開發(fā)與應(yīng)用前景。

參考文獻：

[1] 陳愛平.2005年中國水產(chǎn)養(yǎng)殖病害監(jiān)測報告（三）[J].中國水產(chǎn)，2006（6）：64-66，75.

[2] 邵為旭，韓新全.水產(chǎn)病害中細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的根源及應(yīng)對措施[J].中國水產(chǎn)，2007（6）：64-65.

[3] 洪偉鳴，楊曉志，郁杰，等.一株噬菌蛭弧菌的安全性試驗研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（11）：106-107.

[4] 王光華，Jos M R.生防細(xì)菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)及其在生物防治中的作用冊[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2004，15（6）：1100-1104.

[5] 徐長安，羅秀針，張怡評，等. 一株海洋芽孢桿菌B09的篩選及其發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J] . 海洋通報，2009 （5）：74-78.

[6] Tamehiro N，Okamoto Y，Okamoto S，et a1.Bacilysocin，a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis168[J].Antimicrobial Agents Chemotherapy，2002，46（2）：315-320.

[7] Anith K N，Radhakrishnan N V，Manomohandas T P.Screening of antagonistic bacteria for biological control of nursery wilt of black pepper[J].Microbiological Research，2003，158（2）：91-97.

[8] Tagg J R，McGiven A R. Assay systems for bacteriocins[J]. Applied Microbio，1971：l21-125.

[9] 徐長安，毛勇. 海洋生境枯草芽孢桿菌LHB02抗菌蛋白的分離純化及部分特性分析[J].廈門大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版， 2011，50（5）：922-927.

[10] 布坎南 R E，吉本斯 N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].第八版.北京：科學(xué)出版社，1984.

[11] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[12] 樊海平，徐娟兒.福建省養(yǎng)殖鰻鱺細(xì)菌性疾病的調(diào)查與防治[J].海洋湖沼通報，1996（2）：66-70.

[13] 翟茹環(huán)，尚玉珂，劉 峰，等. 枯草芽孢桿菌G8抗菌蛋白的理化性質(zhì)和抑菌作用[J]. 植物保護學(xué)報，2007，34（6）：593-596.

[14] Asake O， Shoda M. Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off of tomato with Bacillus subtilis RB14[J]. Appl Environ Microbiol，1996，623（1）：4081-4085.

[15] Maget-Dana R，Peypoux F. Iturins， a special class of pore-forming lipopeptides：Biological and physicochemical properties[J].Toxicology， 1994，87：151-174.

[16] 謝棟，彭 憬，王津紅，等. 枯草芽孢桿菌抗菌蛋白X98Ⅲ的純化與性質(zhì)[J]. 微生物學(xué)報，1998，38（1）：13-19.