VEGFR—3的表達與乳腺癌浸潤和轉移關系的研究

王學軍　王獻魁　許衛衛

【摘要】目的研究血管內皮生長因子受體-3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3）在乳腺癌中的表達，探討它的表達與乳腺癌浸潤、轉移的關系及臨床意義。方法應用HE染色觀察乳腺癌的組織學形態和病理學變化；應用免疫組織化學法檢測乳腺癌患者癌組織、癌旁2cm乳腺組織及距癌組織5cm以上的正常乳腺組織中VEGFR-3的表達。結果免疫組化檢測顯示，VEGFR-3在乳腺癌腫瘤組織中的陽性表達率顯著升高（P<0.01）。在乳腺癌組織陽性表達率為63.33%（38/60）；在癌旁組織陽性表達率28.33%（17/60）；而正常組織成陰性表達（0/60）。VEGFR-3在有淋巴結轉移和無淋巴結轉移的乳腺癌組織中的陽性表達率分別為81.25%（26/32）和42.86%（12/28），兩者比較差異有統計學意義（P<0.01）。結論VEGFR-3在乳腺癌中的表達均增高，明顯高于癌旁組織及正常乳腺組織。表達與乳腺癌腫瘤大小、組織學分級、臨床分期、淋巴結轉移密切相關。

【關鍵詞】乳腺癌；VEGFR-3；微血管密度；免疫組化

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.07.001文章編號：1004-7484（2013）-07-3505-02

在全世界范圍內，乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，且其發病率也在逐年上升，己成為威脅婦女健康的主要疾病。近年來在我國，特別是在一些大城市及經濟發展較快的沿海地區，乳腺癌的發病率不斷上升，而且有年輕化的趨勢[1-2]。

腺癌可分浸潤性和非浸潤性兩大類。而浸潤性乳腺癌是乳腺癌的主要類型。乳腺癌的浸潤性是指癌細胞穿破乳腺導管或小葉腺泡的基底膜并浸入周圍組織。浸潤轉移的發生主要是由于癌細胞生長特性的改變而引起，使其脫離原發部位，通過血液及淋巴系統轉移到身體的其它部位，并在新生部位發生增殖，形成新的轉移灶，并不斷侵襲轉移灶周圍的正常組織。

乳腺癌的浸潤和轉移是影響患者生存質量和生存時間的重要因素。相關研究提示乳腺癌的淋巴結轉移或血行轉移與否是對乳腺癌的臨床預后評估的重要指標。

對于大多數腫瘤來說，淋巴道轉移是主要和首發的轉移途徑，腫瘤的淋巴結浸潤是評價腫瘤預后的關鍵指標。血管內皮生長因子受體-3是第一個被克隆的淋巴管內皮標記蛋白分子，同時也是一個重要的淋巴管內皮生長調控因子。VEGFR-3與血管內皮生長因子-C相互作用，調節淋巴管在胚胎階段的發育，誘導淋巴內皮細胞增生，促進新生淋巴管的延伸和新生淋巴竇發育，其在胚胎淋巴系統的形成過程中發揮著重要作用。在人類腫瘤組織中可見腫瘤周邊的新生淋巴管、有癌栓的淋巴管以及有腫瘤轉移的淋巴結內淋巴管內皮細胞VEGFR-3表達增高，而且腫瘤內新生血管內皮細胞VEGFR-3也呈陽性表達。這提示VEGFR-3高表達可能與乳腺癌淋巴轉移有一定的關系。

在體內，血管和淋巴管形成是密切相關的，組織中血管叢出現常伴隨淋巴管生長。雖然，淋巴管與血管的比例在不同的組織中不同；但充分的局部血供和氧供，是淋巴管的生長必要前提，并有助于淋巴管正常功能的發揮以及病理狀態下的快速再生以維持器官體液平衡。因此腫瘤的浸潤和轉移與血管和淋巴管形成和生長有密切的關系。

本研究主要是通過檢測乳腺癌組織標本中VEGFR-3的表達水平探討VEGFR-3表達與乳腺癌浸潤轉移的關系，為乳腺癌浸潤轉移的預防和臨床治療提供一定的理論依據。

1材料和方法

1.1研究對象收集2010年3月至2010年12月駐馬店市第一人民醫院普外科手術切除的原發性乳腺癌病理標本60例。所有患者均為女性，年齡32-73歲，中位年齡47歲。所有患者術前均未行任何化療、放療和內分泌治療；均行乳腺癌改良根治術；其中浸潤性導管癌46例，浸潤性小葉癌14例，而且經病理診斷確診為浸潤型乳腺癌。乳腺癌病理臨床分期采用國際抗癌聯盟（UICC）2003年的TNM分期，其中Ⅰ期15例，Ⅱ期28例，Ⅲ期17例；病理分級按Scarff-Bloom-Richardson分級法，Ⅰ級14例，Ⅱ級29例，Ⅲ級17例；伴淋巴結轉移者32例，無淋巴結轉移者28例。取乳腺癌癌組織、癌旁2cm的乳腺組織及距癌組織5cm以上的正常乳腺組織各一塊，10%中性甲醛固定，生物自動脫水機處理后制成蠟塊備用。

1.2主要實驗儀器及試劑

1.2.1主要實驗儀器TS-12J生物自動脫水機（湖北孝感）；Leica SM2400切片機（德國Leica）公司；LeicaHi1210攤片機（德國Leica公司）；FA1104電子天平（上海精密儀器廠WD800TL23-K3）；微波爐（格蘭氏電器公司）；新飛組合變溫式冰箱BCP-205（新鄉新飛電器公司）；BX51/BX52系統顯微鏡（日本Olympus公司）；OLYMPUS直立光照照相系統（日本Olympus公司）。

1.2.2主要實驗試劑兔抗人乙酰肝素酶多克隆抗體（上海瑞奇生物科技有限公司）；鼠抗人CD34單克隆抗體（北京中杉生物技術有限公司）；兔抗人血管內皮生長因子受體3多克隆抗體（北京中杉生物技術有限公司）；即用型二步法檢測試劑盒（北京中杉生物技術有限公司）；DAB顯色劑（福建邁新生物技術有限公司）。

1.2.3主要緩沖液、工作液

1.2.3.10.02M PBS液（pH7.2-7.6）配法1000ml蒸餾水中加入NaCl8.5g，Na2HPO4·12H2O7.05g，NaH2PO4·2H2O0.52g，（0.1M NaOH調平酸堿度）。

1.2.3.20.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）1000ml蒸餾水中加入枸櫞酸三鈉（C6H5NaO7·2H2O）3.0g，枸櫞酸（C6H8O7·H2O）0.4g，（0.1M NaOH調平酸堿度）。

1.2.3.310%緩沖中性甲醛固定液（500ml）440ml蒸餾水中加入Na2HPO4·12H2O 6.5g，NaH2PO4·2H2O 2.0g，40%甲醛60ml。

1.3研究方法

1.3.1組織切片的制備及染色

1.3.1.1組織切片制備步驟如下①乳腺組織標本固定、脫水、透明、浸蠟和包埋：固定、脫水、透明、浸蠟于自動脫水機進行。10%甲醛溶液固定8h，85%乙醇1h，90%乙醇1h，95%乙醇Ⅰ1h，95%乙醇Ⅱ1h，100%乙醇Ⅰ1h，100%乙醇Ⅱ1h，二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min，浸蠟Ⅰ2h，浸蠟Ⅱ2h，然后進行手工石蠟包埋。②切片、攤片、烤片：制成3um厚切片，冰水中貼片，再于45度攤片水浴槽中攤片，再于63度烤片箱中傾斜45度放置，烤片4h。③脫蠟至水：從烤片箱中取出，即放入二甲苯Ⅰ1h，二甲苯Ⅱ1h，分別于100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇及70%乙醇各3min。

1.3.1.2HE染色蘇木精染色5min，自來水沖洗掉多余的染液，1%鹽酸酒精分化組織1min，自來水充分洗滌后細胞核呈紫藍色。然后，再用1%伊紅染色3min，自來水沖洗，85%乙醇20s，90%乙醇40s，95%乙醇Ⅰ1min，95%乙醇Ⅱ1min，100%乙醇Ⅰ2min，100%乙醇Ⅱ2min，二甲苯Ⅰ和Ⅱ各透明2min，用中性樹膠封片保存。

1.3.2免疫組織化學檢測

1.3.2.1標本處理常規乳腺組織10%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，3um厚度切片。溫控儀電熱恒溫干燥箱內58℃烤片1h。常規石蠟切片脫蠟至水。

1.3.2.2方法即用型二步法（PV-6000）VEGFR-3表達的免疫組織化學檢測。

1.3.2.3染色步驟一抗為兔抗人血管內皮生長因子受體3多克隆抗體（1：100），①蒸餾水洗滌組織標本片2min×3次；②3%H2O2滅活內源性酶，室溫孵育10min。蒸餾水洗滌1min×2次；③微波抗原修復，高火5min，中火5min，取出后室溫冷卻20min；④PBS洗滌5min×3，滴加含5%BSA的封閉液，37℃恒溫箱孵育20min，甩去多余液體，不洗；⑤將標本片置于1/150兔抗人乙酰肝素酶多克隆抗體/5%BSA封閉液中，4℃孵育過夜，PBS洗5min×3次；⑥滴加過氧化物酶連接的山羊抗兔lgG二抗液（1：10000），37℃恒溫箱孵育30min，PBS洗5min×3次；⑦DAB顯色，取1ml蒸餾水，加DAB顯色試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片標本上，室溫下避光顯色，顯微鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌終止反應，蘇木素輕度復染，風化，藍化，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。整個實驗過程中，用PBS代替一抗作空白對照。

1.3.3免疫組化結果判斷VEGFR-3的免疫組織化學結果以細胞漿和（或）細胞膜中出現棕黃色顆粒為陽性顯色，以染色強度和陽性細胞比例來評定它們在組織中陽性表達率。高倍鏡下，每張切片在乳腺癌組織中隨機選取10個視野，每個視野隨機計數100個細胞。染色強度分級如下：無著色為0，淡棕黃色為1，棕黃色及更深顏色為2；陽性細胞數分級為：陽性細胞數≤50%為0，51%-75%為1，≥76%為2。兩項得分相加結果大于2為陽性表達病例。

1.3.4統計學分析采用SPSS13.0統計分析軟件，數據均以χ±s表示，計數資料比較使用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗和單因素方差分析，采用Spearman法進行相關分析。顯著性檢驗水平α=0.05。

2結果

VEGFR-3在乳腺癌組織中的表達。免疫組織化學檢測結果顯示，VEGFR-3在腫瘤細胞及淋巴管內皮細胞均有陽性表達，陽性產物亦為棕黃色顆粒物質。乳腺腫瘤組織內有淋巴管出現，且淋巴管多分布于癌周邊間質組織內；而正常乳腺組織內淋巴管數量較為稀少，且呈閉鎖狀態。

3討論

3.1VEGFR-3的表達與乳腺癌淋巴結轉移的關系血管內皮生長因子受體-3，又名FLT4，為受體型酪氨酸蛋白激酶家族的成員，該受體為最早克隆出來的淋巴管內皮特異性分子標記物。

人的VEGFR-3基因位于5q33-q35區帶上，該基因具有高度保守性，其結構與VEGFR-1、VEGFR-2相似，其由30個外顯子組成；編碼一個分子量為180kd膜蛋白，該蛋白序列由1298個氨基酸組成。VEGFR-3的配體有VEGF-C和VEGF-D兩種，但其主要與VEGF-C結合，VEGF-C主要通過VEGFR-3的調控介導淋巴管的生成。

目前認為，VEGFR-3是正常成年人組織中淋巴管發育的特異性標志物，也是體外培養的淋巴管內皮細胞的唯一標志物，在淋巴管內皮細胞中能保持特異性表達。它作為淋巴管內皮特異性標志物，還能促進淋巴管的發生和發育，是一個淋巴管生長的重要調節因子之一[3]。VEGFR-3在胚胎時期主要是誘導間質中血管內皮細胞的增生與分化；隨著機體的逐漸發育，VEGFR-3在血管內皮的表達量逐漸下調，在成人組織中只限制性地表達于淋巴管內皮細胞中。

關于淋巴管的生成機制，主要有兩個理論：①淋巴管內皮來源于淋巴管母細胞。②靜脈以出芽方式形成淋巴管。由于毛細淋巴管的內皮細胞之間的間隙較大，連接并不緊密，毛細淋巴管沒有連續的基膜，所以腫瘤細胞易于侵入淋巴管，并通過淋巴結轉移。

研究發現，乳腺癌的淋巴轉移率是隨著VEGFR-3陽性表達脈管比例增加而增加的。該研究提示乳腺癌的淋巴結轉移可能是通過VEGFR-3陽性表達脈管（淋巴管）來實現的。Roberts等[4]應用動物模型研究乳腺癌轉移的機制的研究中應用VEGFR-3的抗體特異性阻斷VEGFR-3的作用，結果發現腫瘤的區域及遠處轉移明顯受到了抑制。該研究直接證明了VEGFR-3在癌轉移中發揮著關鍵性作用。

參考文獻

[1]畢曄，邊莉，黃槧，等.我國乳腺癌熱點問題研究的現狀分析[J].中華腫瘤防治雜志，2006，13（16）：1205-1211.

[2]孫強.乳腺癌的早期診斷[J].實用醫學雜志，2007，23（1）：1-3.

[3]丁兆習.淋巴管內皮特異性標志物的研究[J].解剖科學進展，2002，8（4）：355-357.

[4]Roberts N，Kloos B.Inhibition of VEGFR-3 activation with the antagonistis antibody more potently suppresses lymph node and distant metastases than inactivation of VEGFR-2 [J].Cancer Research，2006，66（5）：2650-2657.