Box—Benhnken設計優化植物乳桿菌培養基

張瑤 李嘯 潘冬瑞

摘 要：通過單因素試驗篩選出植物乳桿菌的最適碳源、氮源以及各緩沖鹽、無機鹽等物質的種類及優化濃度。再通過Plackett-Burman試驗設計篩選出顯著影響因子。然后用最陡爬坡試驗逼近關鍵因素的最大響應區域。最后在此基礎上，采用Box-Benhnken試驗設計法對培養基組分進行進一步優化，得出其最佳濃度。結果表明，優化得到3種顯著因子糖蜜、MgSO4、吐溫-80通過響應面優化后的結果分別為23.79%（v/v），0.16%（w/v），1.35%（w/v）。采用優化培養基后活菌數可達到4.45×109cfu·mL-1，較在MRS中培養的活菌數提高12倍左右。

關鍵詞：培養基優化；高密度培養；響應面設計；植物乳桿菌；糖蜜

中圖分類號：S816.7 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.07.001

Media Optimization of Culturing Lactobacillus plantarum by Box-Benhnken Design

ZHANG Yao1， LI Xiao1，2， PAN Dong-rui1

（1.College of Chemistry and Biology，China Three Gorges University， Yichang， Hubei 443003，China；2.Angel Yeast Company Limited，Yichang， Hubei 443003， China ）

Abstract： Lactobacillus plantarum optimum carbon source， nitrogen source and various buffer salts， inorganic salts and other types of substances and preliminary optimized concentration was screened by single factor experiment. Significantly impact factor by Plackett-Burman experimental design was obtained and approached largest response area of the key factor by steepest ascent experiment.On this basis， best optimum concentration of the medium components was obtained by using the Box-Behnken design. The results showed optimal concentration of molasses， MgSO4， Tween-80 was 23.79% （v/v）， 0.16% （w/v）， 1.35% （w/v） respectively. The viable cell count reached 4.45×109cfu·mL-1， which was about 12 times larger than cultured in MRS medium.

Key words： medium optimization； high-density cultivation； response surface design； Lactobacillus plantarum； molasses

植物乳桿菌是乳酸菌的一種，與人類的生活關系非常密切，常見于奶油、肉類及許多蔬菜發酵制品中，能通過胃并定植于腸道發揮有益作用[1]。植物乳桿菌可以將食品原料中的糖轉變為乳酸， 同時產生抗菌肽、胞外多糖和其他代謝產物，供人體吸收利用[2]。

目前在植物乳桿菌培養基優化方面，國內的研究中大多采用葡萄糖、蔗糖等作為碳源，而葡萄糖、蔗糖的價格較高，增大了生產的成本。另外，在國內外的諸多研究中培養基大多使用動植物蛋白胨作為氮源，由于動植物蛋白胨對人體可能帶來致病性、敏感性等一系列安全問題，經此發酵的植物乳桿菌運用到食品和醫療保健等方面就具有一定的風險性。所以，尋求低成本且在安全性上有保證的植物乳桿菌培養基勢在必行。

本研究旨在選擇低成本、安全性高、能顯著促進菌體生長的培養基，為工業生產提供參考依據。在充分考慮培養基成分選擇的前提下，通過Plackett-Burman設計、Box-Behnken 設計等對植物乳桿菌培養基成分進行了系統的優化，最終顯著提升了植物乳桿菌的活菌數。

1 材料和方法

1.1 菌 種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），由安琪酵母股份有限公司提供。

1.2 培養基

1.2.1 基礎培養基 MRS培養基[3]：葡萄糖2%，牛肉膏 1%，蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，檸檬酸三銨0.1%，磷酸酸氫二鉀 0.2%，醋酸鈉 0.5%，硫酸鎂 0.2%，吐溫-80 0.058%，硫酸錳 0.025%，pH 值6.2。

1.2.2 活菌計數培養基 葡萄糖2%，牛肉膏 1%，蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，檸檬酸三銨0.1%，磷酸氫二鉀 0.2%，醋酸鈉 0.5%，硫酸鎂 0.2%，吐溫-80 0.058%，硫酸錳 0.025%，瓊脂粉2%，pH值 6.2。

1.3 培養方法

1.3.1 菌種的活化 將甘油管保存的菌種取1 mL，放入裝有50 mL液體MRS培養基的250 mL三角瓶中，瓶口加棉塞并用保鮮膜密封，于180 rpm搖床在30 ℃的條件下培養13 h。

1.3.2 發酵培養 將培養好的種子液以4%的接種量接入裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，瓶口加棉塞并用保鮮膜密封，于180 r·min-1搖床在30 ℃的條件下培養15 h。

1.4 檢測方法

1.4.1 活菌計數 方法見參考文獻[5]。

1.4.2 OD值測定 發酵液用蒸餾水稀釋適當倍數并震蕩混勻后，用可見分光光度計測定600 nm處的吸收值（OD600）。

1.5 試驗設計方法

1.5.1 Plackett-Burman設計[6] 通過Plackett-Burman設計，對經過單因素試驗挑選出的幾種物質（糖蜜、YE、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80）進一步優化，選出對植物乳桿菌生長的最顯著因子。Plackett-Burman設計采用5因子2水平的試驗設計，每個因素取高（+1）低（-1）兩個水平（以單因素試驗得出的最佳濃度作為參考），其中響應值為活菌數。通過對效應值的計算，同時進行t檢驗，置信度高的因子為最顯著因子。

1.5.2 最陡爬坡試驗 響應面擬合方程只有在考察的整個領域里才能充分擬合近似的真實情形。最陡爬坡試驗能根據各因素效應值的大小，經濟、快速地逼近最佳值區域。根據Plackett-Burman實驗設計的結果，選擇對植物乳桿菌增殖影響顯著的因子（糖蜜、硫酸鎂、吐溫-80），根據t值的大小確定合適的步長和正確的方向，快速逼近最大響應區域。

1.5.3 Box-Behnken 設計[7] 根據 Box- Benhnken 的中心組合試驗設計原理，進一步進行3因素3水平的響應面分析試驗，設計17個試驗點，17個試驗點可以分為兩類，其一是析因點，自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點，共有12個析因點；其二是零點，為區域的中心點，零點試驗重復5次，用以估計試驗誤差。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

通過單因素試驗對植物乳桿菌培養基成分進行篩選，初步優化的配方如下：糖蜜（v/v）28%、YE（w/v） 14%、硫酸鎂（w/v） 0.2%、硫酸錳（w/v） 0.04%、吐溫-80 （w/v） 0.7%、磷酸氫二鉀（w/v） 0.8%、檸檬酸三銨（w/v） 0.4% ，選擇其中顯著的5種物質糖蜜、YE、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80 進行進一步優化。

2.2 Plackett-Burman設計

對糖蜜、YE、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80 5種物質進行Plackett-Burman設計，設計結果和分析如表1、表2所示。

按表1進行Plackett-Burman 試驗，用12種不同質量濃度的培養基進行植物乳桿菌培養。經過方差分析，列出了Plackett-Burman試驗各因素參數的分析結果，由表2可見，糖蜜對植物乳桿菌活菌數的影響非常顯著（P=0.000 7），吐溫-80（P =0.010 5）和硫酸鎂（P=0.035 1）對植物乳桿菌活菌數影響顯著，5種成分的顯著性依次為：糖蜜>吐溫-80>硫酸鎂>硫酸錳>YE。模型的復相關系數R2=0.912 5，相關性較好。

2.3 最陡爬坡試驗

由Plackett-Burman設計的試驗結果，確定主要因素的最陡爬坡路徑，其中糖蜜、硫酸鎂為負效應，應該減少；吐溫-80為正效應，應該增加。其他物質取單因素試驗得到的最優化的濃度。試驗設計及結果如表3所示。

由表3可見，第2組所得到的活菌數最高，故以糖蜜（v/v）24%、硫酸鎂（w/v）0.16%、吐溫-80（w/v）0.8%為Box-Behnken設計的中心點，進行進一步的Box-Behnken設計。

2.4 Box-Behnken 設計

Box-Behnken 設計的結果和方差分析如表4、表5所示。

以試驗結果表4中的活菌數作為響應量，其二階多項式回歸方程常數項和系數的分析如表5所示。然后根據這些新的統計數據，可以得到回歸方程：

活菌數（cfu·mL-1） =41.46-1.17A-1.25 B+3.25C-0.83AB+0.32AC-0.18BC-7.24A2-8.39B2-0.89C2

經方差分析結果表明，該方程的決定系數為R2=0.984 0，Adj R2=0.963 4，說明該模型預測值與實測值之間擬合度好，能解釋96.34%的響應值的變化，只有總變異的3.66%不能用此模型解釋，說明該方程擬合度好，模型精度高。

通過Design Expert 8.0.6對表5中的數據進行二次多元回歸擬合得到二次回歸方程的響應面及其等高線（圖1～圖3）。

由圖1、圖2、圖3可知，3種成分的交互作用明顯。此回歸模型得出Box-Benhnken 設計的最優結果為糖蜜23.7%（v/v）、硫酸鎂0.16%（w/v）、吐溫-80 1.35%（w/v），在此優化條件下的活菌數為4.45×109cfu·mL-1。

2.5 驗證試驗

為了檢測模型優化結果的準確性，按優化的結果配制培養基進行發酵試驗，設置平行組，3次試驗結果的平均活菌數為4.67×109cfu·mL-1，和模型預測值接近，驗證了此模型的準確性。

3 結論與討論

通過Plackett-Burman設計確定影響植物乳桿菌活菌數的3個顯著因子糖蜜、硫酸鎂、吐溫-80。然后用最陡爬坡試驗對顯著因素進行優化，從而確定影響植物乳桿菌活菌數的最佳值區域。通過Box-Behnken設計確定培養植物乳桿菌優化培養基的3個顯著因素的濃度分別為糖蜜23.7%（v/v）、硫酸鎂0.16%（w/v）、吐溫-80 1.35%（w/v）。在此優化條件下的活菌數為4.45×109cfu·mL-1，驗證實驗中用優化后的培養基對植物乳桿菌培養，得到的活菌數為4.67×109cfu·mL-1，說明了模型的可靠性。

優化后得到的活菌數相對于優化前在MRS中培養得到的植物乳桿菌活菌數3.87×108cfu·mL-1，提高了12倍左右。

用響應面法（RSM）建立了植物乳桿菌高密度培養工藝的模型。從模型的曲面圖就能獲得工藝參數大概的取值范圍，有利于工藝參數的選擇和工藝條件的優化[7]。優化后較優化前活菌數目提高了12倍，說明響應面法的試驗統計方法能快速、有效地對影響植物乳桿菌發酵的培養基成分實現優化，得到最佳配比。

工業生產需要考慮生產成本問題，生產廢料的再利用和提高發酵工藝是現在工業生產的必經之路。糖蜜是制糖工業的副產品，價格相對而言比較低廉[8]，但其含有豐富的營養成份，除了含有大量的發酵糖以外，還含有少量的蛋白質、氨基酸和礦物質[9]，能夠很好促進植物乳桿菌的生長。

本研究選擇食糖加工過程中的副產品蔗糖糖蜜作為植物乳桿菌培養基的碳源，這是因為蔗糖糖蜜不僅成本較低，而且含有豐富的發酵糖和少量的蛋白質、氨基酸，其中天門冬氨酸、谷氨酸含量較多，除此之外，礦物質的含量也較高，如鉀、氯、鈉、鎂等。培養基的氮源選擇酵母浸出物FM888，酵母浸出物是以蛋白質含量豐富的酵母為原料，采用生物技術將酵母細胞內的蛋白質、核酸等進行降解而成，含有豐富的多肽和氨基酸[10]，作為植物乳桿菌培養基的氮源非常安全，不會對人體造成致病性及一些過敏現象等。所以采用糖蜜作為培養基成分不但可以解決高成本問題，而且在營養成分方面表現出“多面手”的角色，所以選擇糖蜜來發酵可以起到一舉多得的效果。

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